BioPRYN 酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牛早孕的應(yīng)用研究

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011517）

國(guó)際上通常將奶牛從分娩到首次適宜輸精的時(shí)間間隔稱為“自愿等待期”（voluntary waiting period，VWP）[1]。不同奶牛之間的最佳VWP不同，37%的奶牛最佳VWP為6周，63%的奶牛最佳VWP小于8周，大約10%的牛VWP大于9周。奶牛產(chǎn)奶需要經(jīng)過(guò)配種、懷孕、分娩等環(huán)節(jié)。配種技術(shù)相對(duì)較易掌握，但如何在配種后的等待期及早進(jìn)行妊娠鑒定，以發(fā)現(xiàn)空懷奶牛，及時(shí)補(bǔ)配并縮短胎間距，以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)奶量和利潤(rùn)的最大化則是相對(duì)復(fù)雜而且十分重要的問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每增加一天空懷，飼料成本增加40元以上。按照減少15d的空懷天數(shù)來(lái)計(jì)算，每頭?？晒?jié)省成本600元。理想的早期妊娠診斷技術(shù)應(yīng)該包括以下特點(diǎn)：①在配種后一個(gè)發(fā)情周期之內(nèi)顯示出診斷結(jié)果；②對(duì)于妊娠和未妊娠家畜的診斷準(zhǔn)確率在 85%以上；③對(duì)母體和胎兒無(wú)害；④方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確實(shí)用[2]。近些年早期妊娠診斷方法高速發(fā)展，新方法不斷涌現(xiàn)，一些曾處于實(shí)驗(yàn)發(fā)展階段的方法[3]逐漸成熟。通過(guò)檢測(cè)奶牛血液中妊娠特異性蛋白（PSPB）含量作為判斷妊娠標(biāo)志的方法便是其中之一，該方法在奶牛及相近物種的妊娠檢測(cè)中具有較高的靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性[4]。PSPB來(lái)源于胚胎組織，在雙核細(xì)胞遷移下進(jìn)入血液循環(huán)，有些奶牛在配種后15d開(kāi)始產(chǎn)生PSPB，所有的奶牛從懷孕后第28天開(kāi)始都會(huì)產(chǎn)生PSPB[5]，一直到整個(gè)妊娠周期都在血液中以不同濃度存在，與懷孕天數(shù)有著良好的相關(guān)性[6]。美國(guó)BioTracking公司的BioPRYN早孕診斷試劑盒依據(jù)酶聯(lián)免疫原理可以對(duì)懷孕早期奶牛血液中的PSPB進(jìn)行檢測(cè)。本研究旨在評(píng)價(jià)該方法的檢測(cè)準(zhǔn)確性從而豐富牧場(chǎng)懷孕奶牛的早期診斷手段，服務(wù)于生產(chǎn)管理，增進(jìn)牧場(chǎng)收益[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

配后待檢母牛92頭，其中呼和浩特蒙德隆牧場(chǎng)26頭（配種后30～380d），呼和浩特賽罕牧場(chǎng)66頭（配種后17～183d）。

1.2 主要試劑與儀器

BioPRYN牛早孕檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BioTracking公司。

離心機(jī)（型號(hào)為5424R），購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)為ELx808IU)，購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；20～200mL移液器（型號(hào)為Transferpette），8道移液器（型號(hào)為Transferpette-8），購(gòu)自德國(guó)BRAND公司；洗板機(jī)（型號(hào)為ELX508），購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；旋渦混合儀（型號(hào)為MS3 BASIC），購(gòu)自德國(guó)IKA公司。

1.3 BioPRYN 牛早孕檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

以吸光度值為縱坐標(biāo)，以PSPB濃度值為橫坐標(biāo)繪制BioPRYN標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 BioPRYN 牛早孕檢測(cè)試劑盒法及觸診法檢測(cè)奶牛懷孕狀況比對(duì)

1.4.1 傳統(tǒng)直腸檢查觸摸診斷法檢測(cè)奶牛懷孕情況

繁殖技術(shù)人員通過(guò)直腸檢查，依據(jù)黃體的方位、發(fā)育生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，子宮角的變化大小，子宮角內(nèi)壓力與波動(dòng)感的狀態(tài)，子宮壁柔軟程度以及觸摸有無(wú)胎膜的滑落感來(lái)判定奶牛是否受孕[5]。

1.4.2 BioPRYN牛早孕診斷試劑盒檢測(cè)奶牛懷孕情況

首先利用真空采血管采集母牛血液樣本，然后用BioPRYN牛早孕診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。第一步，加樣孵育：用樣品緩沖液50μL濕潤(rùn)酶標(biāo)孔，之后分別添加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液150μL，用蓋板膜密封，蓋好微孔蓋，在室溫20～25℃下孵育4h；第二步，檢測(cè)反應(yīng)：孵育結(jié)束后，取下蓋板膜，用洗滌液沖洗酶標(biāo)板4次，添加檢測(cè)溶液室溫再次孵育1h；第三步，增強(qiáng)反應(yīng)：1h孵育結(jié)束后再次洗板2次，加入增強(qiáng)試劑（即酶標(biāo)抗體），于室溫孵育1h；第四步，顯色反應(yīng)：增強(qiáng)反應(yīng)結(jié)束后，洗板4次，之后每孔加入TMB底物試劑200μL，室溫反應(yīng)15min；第五步，終止反應(yīng)：每孔加入100μL終止液；第六步，結(jié)果讀?。杭尤虢K止液后30min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，讀數(shù)波長(zhǎng)為650nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 BioPRYN牛早孕診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 BioPRYN試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.9951，PSPB濃度和吸光度值之間具有良好的線性相關(guān)性，見(jiàn)圖1。

2.2 觸診結(jié)果與試劑盒檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

表1 92組樣本的觸診法及BioPRYN 酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測(cè)結(jié)果

表1數(shù)據(jù)看出，92組檢測(cè)結(jié)果，兩種方法最終得出一致結(jié)論的有87組，不一致的有5組，總體符合率為94.6%。其中得出不一致結(jié)論的5組奶牛配種天數(shù)為26～34d，可能是由于在奶牛配種后一個(gè)月左右的初始階段，PSPB在不同奶牛個(gè)體血液中的含量不夠穩(wěn)定，存在差異，處在試劑盒檢出限濃度附近，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差。橫向比對(duì)配種天數(shù)處于35d及以下奶牛試劑盒檢測(cè)結(jié)果的OD值，介于0.045～0.804之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為50.9%。

此外，在BioPRYN方法的檢測(cè)結(jié)果中，存在2例Recheck的結(jié)果，配種天數(shù)分別為27d和30d，占檢測(cè)總數(shù)的1.8%。一般情況下，Recheck的結(jié)果均建議7d后重檢，數(shù)據(jù)中Recheck對(duì)應(yīng)的BioPRYN OD值分別為0.150和0.158，在低Recheck的0.135～0.160范圍內(nèi)，因此該結(jié)果可看作為較多空懷概率。一周后觸診法復(fù)檢均為空懷。

BioPRYN方法檢測(cè)結(jié)果中有69例為懷孕，配種天數(shù)為26～183d，占比75.0%；21例為空懷，配種天數(shù)為34～380d，占比22.1%。兩周后用觸診法進(jìn)行檢查，有64例懷孕，占比69.6%，而空懷有28例，占比30.4%。如果以觸診法為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，且試劑盒Recheck檢測(cè)結(jié)果為陰性，則利用BioPRYN方法檢測(cè)為空懷23例（含Recheck結(jié)果），觸診確認(rèn)均為空懷，先空懷后孕結(jié)果的概率為0，即BioPRYN的空懷結(jié)論用觸診法100.0%證實(shí)，準(zhǔn)確率為100.0%，假陽(yáng)性率為0。利用BioPRYN方法檢測(cè)懷孕69例，觸診確認(rèn)懷孕64例，有5例結(jié)果不一致，準(zhǔn)確率為92.8%，假陰性率為7.2%。

3 討論

從檢測(cè)結(jié)果分析可知，BioPRYN技術(shù)檢測(cè)未孕奶牛準(zhǔn)確率為100.0%，實(shí)際應(yīng)用中可以在母牛配種26d以后，對(duì)全體母牛進(jìn)行BioPRYN檢測(cè)，如果結(jié)果為空懷，可以直接進(jìn)行配種準(zhǔn)備；如果結(jié)果為懷孕，則應(yīng)分為兩種情況：①為了避免BioPRYN技術(shù)的檢測(cè)誤差，一周后應(yīng)利用其他孕檢方法進(jìn)行復(fù)檢，確保結(jié)果準(zhǔn)確；②奶牛懷孕是一個(gè)持續(xù)的過(guò)程，存在一定的自然流產(chǎn)率。根據(jù)美國(guó)統(tǒng)計(jì)的奶牛數(shù)據(jù)，30d左右確認(rèn)懷孕后又在60d左右確認(rèn)流產(chǎn)的概率為10%～18%。因此可以在母牛配種后42～49d，對(duì)已確認(rèn)懷孕的奶牛中OD值較小的牛只進(jìn)行復(fù)檢，根據(jù)復(fù)檢結(jié)果進(jìn)行不同處理。同時(shí)與26d的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)明顯變小的牛只需重點(diǎn)查看；在母牛配種60～67d，為了避免10%～18%的“先孕后空懷”的空懷牛只遺漏未查出以致錯(cuò)過(guò)配種時(shí)間，建議對(duì)全體奶牛進(jìn)行再一次BioPRYN檢測(cè)。但需根據(jù)牧場(chǎng)的實(shí)際情況，計(jì)算以往的流產(chǎn)比率和再次全體檢測(cè)的投入費(fèi)用，以衡量是否再進(jìn)行全面檢查，或用合適的方法進(jìn)行檢查。

綜上，BioPRYN技術(shù)檢測(cè)奶牛未孕的準(zhǔn)確率可達(dá)100.0%，懷孕的準(zhǔn)確率可達(dá)92.8%。檢測(cè)簡(jiǎn)便而快速，可以在早期對(duì)奶牛受孕情況進(jìn)行大通量排查，同時(shí)可以配合傳統(tǒng)檢測(cè)方法及時(shí)發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)奶牛[8]，為規(guī)模化牧場(chǎng)奶牛配種管理和成本控制提供技術(shù)保障。