唑來膦酸聯(lián)合胰島素促進2型糖尿病并發(fā)雌激素缺乏大鼠骨折早期愈合

曹國龍 劉光源 劉小坡 馮云波 劉家寅 田發(fā)明

1.唐山市工人醫(yī)院骨外科，河北 唐山 063000 2.石家莊市第三醫(yī)院骨外科，河北 石家莊 050000 3.唐山市第二醫(yī)院骨外科，河北 唐山 063000 4.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心，河北 唐山 063210

大約40%的女性一生中會經(jīng)歷一次脆性骨折[1]。而在骨折患者中，又會有10%～15%的比率出現(xiàn)骨折愈合延遲[2]，其中老年人會占很大比例。發(fā)生骨折的老年女性患者，常同時患有2型糖尿病和骨質(zhì)疏松癥。它們不僅使骨折發(fā)生率明顯升高[3]，還不同程度地影響著骨折的愈合[4-6]。

胰島素是治療2型糖尿病的常用藥物之一，它對骨折愈合的影響值得研究。而雙膦酸鹽類藥物廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松患者的治療，它主要是對破骨細胞功能有明顯的抑制作用[7]。而唑來膦酸作為新一代雙膦酸鹽類藥物，每年只需靜脈輸入一次(5 mg)既可明顯降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率[8]。并且唑來膦酸較其他抗骨質(zhì)疏松藥物不僅有更好的療效[9-10]，還有著更好的依從性[11]。但長期應(yīng)用此類藥物可延遲骨痂重建[12]，骨折后如何應(yīng)用值得深入研究?；谝陨显颍菊n題參照以往文獻[13-14]，通過高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合注射低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型。在此基礎(chǔ)上行雙側(cè)卵巢切除，建立2型糖尿病并發(fā)雌激素缺乏股骨干閉合性骨折動物模型，通過給予胰島素或聯(lián)合唑來膦酸治療，以研究其對于本模型骨折早期愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2月齡雌性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，購于北京維通利華公司，許可證號：SCXK(京)2015-0001，體重(219.64±11.48) g。

1.2 實驗分組

32只大鼠隨機分為4組(n=8)：對照組(control fracture，CF)、2型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis+Fracture，DOF)、胰島素治療組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin，DOFI)和胰島素聯(lián)合唑來膦酸治療組(T2DM+Osteoporosis+ Fracture +Insulin+Zoledronic acid，DOFIZ)。本實驗嚴(yán)格遵守實驗動物倫理原則，各項操作均通過倫理委員會批準(zhǔn)。實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Fig.1 Flow chart of the experimental procedures注：“_”：普通飼料喂養(yǎng)；“...”：高脂飼料喂養(yǎng)；STZ：腹腔注射STZ；OVX：雙側(cè)卵巢切除；：建立閉合性股骨干骨折模型；：取材；“Insulin”：胰島素治療；“Insulin +Zoledronic acid”：胰島素聯(lián)合唑來膦酸治療。

1.3 實驗大鼠飲食

CF組正常大鼠飼料喂養(yǎng)，其余3組高脂飼料喂養(yǎng)(H10141，北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.4 建立2型糖尿病及雌激素缺乏動物模型

三實驗組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)3周后，以35 mg/kg給予其腹腔注射STZ[14]。一周后測晨起空腹血糖，以大于13.9 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)[15]，未達標(biāo)者被排除。STZ注射1周后，三實驗組大鼠行雙側(cè)卵巢切除。

1.5 胰島素控制血糖

DOFI組和DOFIL組大鼠在STZ注射1周后，給予胰島素(諾和靈N，Novo Nordisk A/S)皮下注射，劑量為早2～4單位、晚4～6單位[16]。

1.6 建立股骨干閉合性骨折模型

實驗第10周建立骨折模型。手術(shù)流程：麻醉后術(shù)區(qū)剃毛、消毒、鋪單。于大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切長約2 cm縱行切口，并屈曲膝關(guān)節(jié)，向外側(cè)脫位髕骨，于股骨髁間插入制備好的20 G注射器針頭[17]，縫合切口。用500 g重物自30 cm高度墜落撞擊，致大鼠右側(cè)股骨中段閉合性骨折[18]。

1.7 唑來膦酸給藥方法

骨折模型建立后，DOFIL組大鼠即刻以0.1 mg/kg給予唑來膦酸注射液(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，規(guī)格：100 mL：5 mg)皮下注射[12]。

1.8 采集X線片并分析

骨折后第3周，通過數(shù)字放射成像系統(tǒng)(DR 7500)拍攝右側(cè)股骨干全長X線片，對其行骨折愈合評分[19]，并利用Image Pro Plus6.0軟件測量X線片中骨痂面積[20]。

1.9 Mirco-CT分析

利用mCT-40系統(tǒng)對骨痂組織掃描。設(shè)置檢測參數(shù)及測量區(qū)域：骨折線平面作為基線，向兩側(cè)各選擇381層的軸位片[21]。分析指標(biāo)：骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Th.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨體積分數(shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.10番紅O-固綠染色及分析

骨組織經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行番紅O-固綠染色。用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX53，日本)采集圖像，通過Image Pro Plus6.0軟件分別圈選骨痂及其中的骨和軟骨組織，計算各組織所占骨痂總面積的比值[22]。

1.11抗酒石酸酸性磷酸酶染色及分析

切片經(jīng)脫蠟、水合后，依次滴加抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)固定液、孵育液，經(jīng)Lea蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。采集圖像后分析TRAP陽性破骨細胞密度[23]。

1.12免疫組織化學(xué)染色及分析

切片經(jīng)脫蠟、水合后，依次滴加胰酶、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、一抗：骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體(bs-0470R，博奧森生物有限公司)，半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)抗體(ab179517，Abcam Corp.)，4 ℃過夜，滴加二抗(PV6000)，DAB溶液顯色，再經(jīng)復(fù)染、返藍、脫水、透明和封片。采集圖像后行免疫組織化學(xué)評分(Immunohistochemical score，IHS)[24]。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠基本情況

STZ注射后3只大鼠死亡(DOF組2只，DOFI組1只)，DOFI組和DOFIZ組各有1只大鼠血糖未達標(biāo)均去除。

2.2 大鼠空腹血糖值

三實驗組大鼠在STZ注射后空腹血糖均明顯升高。胰島素治療后，DOFI組和DOFIL組大鼠空腹血糖均趨于正常。見圖2。

圖2 4組大鼠血糖變化Fig.2 Blood glucose changes in the four groups

2.3 骨折愈合X線評分及骨痂面積

DOF組和DOFI組骨折愈合X線評分顯著低于CF 組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFIZ組與CF組、DOFI組間均無顯著差異；DOFIZ組骨痂面積顯著高于其余3組(P<0.05)，此3組間無顯著差異。見圖3。

圖3 各組大鼠X線表現(xiàn)(A)、骨折愈合X線評分(B)及骨痂面積(C)Fig.3 Representative radiographies (A), radiographic healing score (B), and callus area (C) in rats of each group注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.4 Micro-CT分析結(jié)果

三實驗組TB.N和BV/TV均顯著低于CF組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFIZ組顯著高于DOFI組(P<0.05)；三實驗組Tb.Sp顯著高于CF組(P<0.05)，DOFIL組顯著低于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOF組和DOFI組間無顯著差異；4組間Tb.Th均無顯著差異。見圖4。

圖4 各組大鼠骨痂Mirco-CT三維重建圖像(A)及各指標(biāo)分析結(jié)果(B～E)Fig.4 Three-dimensional reconstruction images (A) and results of micro-CT analysis of the callus (B-E)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.5 番紅O-固綠染色及分析結(jié)果

CF組和DOFIZ組骨性骨痂面積比均顯著高于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOFI組顯著高于DOF組(P<0.05)，CF組和DOFIZ組間無顯著差異；4組間軟骨性骨痂面積比均無顯著差異。見圖5。

圖5 各組大鼠骨痂番紅O-固綠染色(×20)(A)及組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果(B、C)Fig.5 Safranin O-Fast Green staining of the callus (×20, A) and histomorphometric analysis results (B, C)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.6 TRAP染色及TRAP陽性破骨細胞密度

CF組和DOFIZ組TRAP陽性破骨細胞密度均顯著低于DOF組和DOFI組(P<0.05)，DOFI組顯著低于DOF組(P<0.05)，CF組和DOFIZ組間無顯著差異。見圖6。

圖6 各組大鼠骨痂TRAP染色(×200)(A)及TRAP陽性破骨細胞密度(n/mm2)(B)Fig.6 TRAP staining of the callus (×200, A) and TRAP-positive osteoclasts per callus area (n/mm2, B)注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

2.7 骨痂內(nèi)OCN和Caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及分析

三實驗組骨痂內(nèi)OCN的表達均顯著低于CF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組顯著高于DOF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組間無顯著差異。

DOF組的骨痂內(nèi)Caspase-3的表達顯著高于其余3組(P<0.05)，DOFI組和DOFIZ組顯著高于CF組(P<0.05)，DOFI組和 DOFIZ組間無顯著差異。見圖7。

圖7 各組大鼠骨痂內(nèi)OCN(A)和Caspase-3(B)的免疫組織化學(xué)染色(×200)及免疫組織化學(xué)評分(C、D)Fig.7 Immunohistochemistry staining (×200, A, B) and immunohistochemical score (HIS, C, D) for OCN and Caspase-3 in the callus注：與CF組比較，aP<0.05；與DOF組比較，bP<0.05；與DOFI組比較，cP<0.05。

3 討論

本實驗在2型糖尿病并發(fā)雌激素缺乏骨折動物模型基礎(chǔ)上，研究了單獨應(yīng)用胰島素或聯(lián)合早期單劑量唑來膦酸對其早期骨折愈合的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合用藥不僅進一步抑制了骨痂內(nèi)破骨細胞活性，提高了其骨性骨痂面積比，還明顯改善了其骨痂的微結(jié)構(gòu)。

本研究中，實驗大鼠并發(fā)有影響骨折愈合的兩種疾?。?型糖尿病和雌激素缺乏[25-26]，它們之間關(guān)系密切并相互影響[27-28]。DOF組不僅骨折愈合X線評分明顯低于CF組，而且其Tb.N、Tb.Sp、BV/TV、骨性骨痂面積比以及OCN的表達也明顯受損。另外，DOF組破骨細胞密度及Caspase-3的表達均明顯高于CF組，這與以往研究結(jié)果也相似[29]。DOF組骨痂各項指標(biāo)受損正是以上兩種疾病共同作用的結(jié)果。

經(jīng)胰島素干預(yù)后，DOF組各項受損指標(biāo)中除了Tb.Sp以外均得到了明顯改善，這與以往的研究結(jié)果相似。胰島素不僅能逆轉(zhuǎn)因糖尿病引起的骨痂內(nèi)軟骨細胞凋亡和破骨細胞增加[29]，還能改善其骨痂的骨量及微結(jié)構(gòu)[30]。胰島素的作用可能是多方面的。首先，它直接扭轉(zhuǎn)了高血糖狀態(tài)對成骨細胞的抑制作用[27]；另外，它不僅能促進血管內(nèi)皮生長因子的表達[31]，還能促進OCN的分泌[32]。本實驗結(jié)果也顯示，DOFI組OCN的表達明顯增高。盡管胰島素有諸多有利作用，但一些研究卻表明其與骨折風(fēng)險增加有關(guān)[33-34]。而有趣的是，胰島素應(yīng)用時間與骨折風(fēng)險無關(guān)[34]，這表明骨折風(fēng)險的增加可能不是來自于其對骨代謝的直接影響，而可能是由于胰島素治療引起的低血糖增加了跌倒事件中骨折的發(fā)生[35]。

DOFIZ組按0.1 mg/kg給予大鼠唑來膦酸皮下注射，這相當(dāng)于人類每年接受一次的5 mg的藥物劑量[12]。骨質(zhì)疏松癥患者常是在骨折發(fā)生后才被確診，此時能否立即行唑來膦酸治療值得深入研究。大鼠骨折愈合的組織學(xué)表現(xiàn)會比人類早1～2周，其骨折后3周相當(dāng)于人類的第4～5周，是骨性骨痂形成和骨痂重塑相交的重要階段[36]，故本實驗選此時為研究靶點。破骨細胞在此時骨吸收和重建中起著重要作用[10]，而唑來膦酸的主要作用機制就是抑制其功能。本研究表明，DOFIZ組破骨細胞密度顯著低于DOFI組，而它們OCN的表達并無顯著差異，這與以往的研究結(jié)果一致[37]。另外，Caspase-3在DOFIZ組也沒有得到明顯改善。以上結(jié)果表明，早期應(yīng)用唑來膦酸主要抑制了骨痂內(nèi)破骨細胞功能，而對于成骨活性和軟骨性骨痂的礦化并無明顯影響。正是因為破骨細胞功能受損，使得DOFIZ組在骨折后第3周保留了更多骨性骨痂，使其骨性骨痂面積比顯著高于DOFI組，并且其骨折愈合X線評分和骨性骨痂面積比與CF組相當(dāng)，甚至其骨痂面積明顯大于其他3組，Tb.N、Tb.Sp和BV/TV也得到了顯著改善，這與以往研究結(jié)果相似[12，38-39]。這些研究也表明，雖然雙膦酸鹽類藥物會延遲骨痂重建，但這并不能降低早期骨痂的結(jié)構(gòu)強度，較大的骨痂反而增強了其生物力學(xué)性能。骨折端早期穩(wěn)定性的增加使患者能更早的功能鍛煉，這對于控制血糖、預(yù)防多種臥床并發(fā)癥，甚至是骨痂重塑都有重要意義。

有研究還指出，破骨細胞在骨痂早期重建中并不是起骨吸收作用的唯一因素。骨痂早期重建是多種基質(zhì)金屬蛋白酶協(xié)同作用的結(jié)果[40]。并且唑來膦酸單次給藥只與短期內(nèi)骨痂組織結(jié)合[12]，并不影響其后新生的骨組織[39]，雖然這在一定程度上影響了早期骨痂重建，但是對于骨折的最終愈合并無明顯影響[38]。另外，唑來膦酸不僅不會增加糖尿病的患病風(fēng)險[41]，還有利于減輕胰島素抵抗[42]和糖尿病并發(fā)癥的治療[43]。

本實驗結(jié)果表明，針對患2型糖尿病的絕經(jīng)后女性骨折患者，在給予胰島素控制血糖的同時，可考慮早期聯(lián)合單劑量唑來膦酸治療，這對于此類患者的治療有一定的指導(dǎo)意義。