6 060例新生兒遺傳性耳聾基因篩查結(jié)果分析

王雪超，李雨雨，崔玉晗，郭志華，王盛

淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院，山東淄博255400

耳聾是常見(jiàn)的單基因遺傳病，也是常見(jiàn)的出生缺陷之一。據(jù)我國(guó)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，每1 000個(gè)新生兒中就有1～3例聾兒，并且每年以3萬(wàn)人的速度在增長(zhǎng)[1，2]，因此非常有必要應(yīng)用耳聾基因檢測(cè)聯(lián)合聽(tīng)力篩查來(lái)預(yù)防耳聾的發(fā)生。目前，國(guó)際上共鑒定了97個(gè)非綜合征型耳聾基因，152個(gè)相關(guān)位點(diǎn)[3]。長(zhǎng)期以來(lái)，臨床研究主要針對(duì)4種常見(jiàn)的耳聾基因，包括GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3[2～5]等進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)，許多研究者開(kāi)始增加基因檢測(cè)種類，如針對(duì)9種常見(jiàn)的耳聾基因甚至更多耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)[1～5]，以期及早發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變。臨淄地區(qū)二孩政策放開(kāi)后，出生人口增加35%以上。臨淄地區(qū)自2017年7月開(kāi)始進(jìn)行新生兒耳聾基因篩查。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨淄地區(qū)6 060例新生兒的18個(gè)遺傳性耳聾基因的100個(gè)位點(diǎn)，全面、快速分析耳聾基因突變情況，為先天性、遲發(fā)性、藥物性耳聾提供治療依據(jù)和預(yù)防指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年7月～2018年10月在臨淄區(qū)人民醫(yī)院和婦幼保健院出生并自愿接受耳聾基因檢測(cè)的6 060例新生兒為研究對(duì)象。新生兒中，男3 092例、女2 968例，出生Apgar評(píng)分7～10分；母親年齡19～42歲，出生孕周37～41周。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得新生兒監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 方法 采集出生3～7 d充分哺乳的新生兒足跟血，制成≥8 mm的干血斑，于4 ℃保存。采用Mag Pure Blood DNA LQ Kit提取耳聾血片中的模板基因組DNA，并利用Qubit熒光計(jì)(Invitrogen)進(jìn)行定量分析。采用引物-特異性標(biāo)簽序列進(jìn)行多重PCR技術(shù)構(gòu)建DNA文庫(kù)并定量，利用One Touch2自動(dòng)化乳液PCR儀擴(kuò)增測(cè)序模板并使用ES磁珠純化儀進(jìn)行富集，采用Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit上機(jī)測(cè)序，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。共檢測(cè)18個(gè)基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、MT-RNR1、MT-COI、MT-TL1、MT-TS1、MT-TH、DSPP、GPR98、DFNA5、TMC1、MYO7A、TECTA、DLABLO、COCH、MYO15A、PRPS1)的共100個(gè)位點(diǎn)。BioelectronSeq 4000高通量測(cè)序儀購(gòu)于北京博奧生物有限公司。對(duì)于陽(yáng)性位點(diǎn)再使用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，分析數(shù)據(jù)打印報(bào)告。另外，對(duì)于純合或復(fù)合雜合突變的患兒，再采集父母雙方的外周血進(jìn)行家系突變位點(diǎn)的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因單基因突變位點(diǎn)篩查結(jié)果 6 060例受檢新生兒中，共檢出耳聾基因突變者404例，突變攜帶率為6.67%。單基因雜合突變391例，其中GJB2突變攜帶者157例，攜帶率2.59%(157/6 060)；SLC26A4突變攜帶者169例，攜帶率2.79%(169/6 060)；GJB3突變攜帶者18例，攜帶率0.30%(18/6 060)；線粒體耳聾相關(guān)基因突變攜帶者46例，攜帶率0.76%(46/6 060)；MYO7A突變攜帶者1例，攜帶率0.02%(1/6 060)。見(jiàn)表1。

表1 6 060例新生兒耳聾基因單基因突變位點(diǎn)篩查結(jié)果

2.2 兩個(gè)及以上耳聾基因位點(diǎn)突變篩查結(jié)果 404例耳聾基因突變者中發(fā)現(xiàn)13例兩個(gè)及以上耳聾基因位點(diǎn)突變，突變攜帶率0.21%(13/6 060)。其中，GJB2基因c.299-300delAT純合突變1例，GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT復(fù)合雜合突變1例、雙雜合突變10例，以及罕見(jiàn)的GJB2/SLC26A4 c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三個(gè)位點(diǎn)突變1例。見(jiàn)表2。同時(shí)，對(duì)這些特殊新生兒進(jìn)行定期隨訪并提供遺傳咨詢和指導(dǎo)，分別采集GJB2基因c.299-300delAT純合突變、GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT復(fù)合雜合突變、c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三個(gè)位點(diǎn)突變新生兒父母的外周血，進(jìn)行Sanger位點(diǎn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)3例基因突變均來(lái)自新生兒父母雙方。見(jiàn)圖1。

表2 6 060例新生兒兩個(gè)及以上耳聾基因位點(diǎn)突變篩查結(jié)果

注：A為GJB2基因c.299-300delAT純合突變；B為GJB2基因c.235delC雜合突變；C為GJB2基因c.299-300delAT雜合突變；D為SLC26A4基因c.2168A>G雜合突變。

2.3 追蹤隨訪結(jié)果 對(duì)6 060例新生兒于出生后3～7 d使用美國(guó)產(chǎn)ALG03I(AABR)聽(tīng)力篩查儀進(jìn)行聽(tīng)力篩查，56例新生兒未通過(guò)聽(tīng)力篩查，轉(zhuǎn)診至聽(tīng)力檢查中心。生后6個(gè)月確診聽(tīng)力異?；純?2例，其中雙耳重度耳聾6例，左耳輕度、右耳重度耳聾4例，左耳重度、右耳中度耳聾2例。12例患兒中，攜帶耳聾基因8例(66.67%)，GJB3基因突變3例，GJB2基因突變4例，SLC26A4基因突變1例。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，引起耳聾的主要原因有遺傳因素(約占60%)和環(huán)境因素[3]。在所有遺傳性耳聾中，約70%為非綜合征型耳聾，其余30%為綜合征型耳聾，即除耳聾外還伴有其他相關(guān)器官或系統(tǒng)疾病[1]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了6 060例新生兒的18個(gè)耳聾基因的100個(gè)位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變404例，突變攜帶率6.67%，高于北京市海淀區(qū)的4.7%[5]、長(zhǎng)治地區(qū)的5.15%[6]和珠海市的4.2%[1]。臨淄地區(qū)耳聾基因突變檢出率高于全國(guó)大部分地區(qū)，可能與檢測(cè)基因位點(diǎn)多、覆蓋面廣、各地遺傳背景存在差異有關(guān)。

6 060例新生兒中，4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體基因)的常見(jiàn)20個(gè)位點(diǎn)突變攜帶率為4.9%。該攜帶率略高于韓萍等[5]研究的4.7%(北京海淀區(qū)90 816例新生兒，檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因9個(gè)位點(diǎn))；高于潘麗等[1]研究的4.2%(珠海市9 775例新生兒，檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因20個(gè)位點(diǎn))；略低于李曉澤等[6]研究的5.15%(長(zhǎng)治地區(qū)19 113例新生兒，檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因9個(gè)位點(diǎn))。這表明檢測(cè)相同耳聾基因和位點(diǎn)，所得到的突變攜帶率與全國(guó)其他地區(qū)基本一致[4，7，8]。

GJB2基因是導(dǎo)致非綜合征型遺傳性耳聾最常見(jiàn)的突變基因，該基因位于13q11～q12，編碼縫隙連接蛋白26，屬于常染色體隱性遺傳[7]。該基因純合或復(fù)合雜合突變可導(dǎo)致雙耳先天性重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾，發(fā)病年齡主要在嬰幼兒期[8]。本次篩查共檢出157例(攜帶率2.59%)GJB2單基因雜合突變、6例雙雜合突變；同時(shí)檢出1例純合突變、1例復(fù)合雜合突變、1例三個(gè)位點(diǎn)突變，對(duì)這3例患兒進(jìn)行重點(diǎn)隨訪，目前患兒均在1～2歲，對(duì)聲音反應(yīng)較好，可能為遲發(fā)性耳聾，建議定期監(jiān)測(cè)聽(tīng)力，如發(fā)現(xiàn)異常需盡早干預(yù)。SLC26A4基因位于7q31，編碼穿膜蛋白Pendrin，屬于常染色體隱性遺傳，其突變會(huì)導(dǎo)致先天性或遲發(fā)性耳聾，通常伴有前庭水管擴(kuò)大，建議避免頭部外傷和感冒等[9]。本研究篩查發(fā)現(xiàn)169例(攜帶率2.79%)SLC26A4單基因突變，4例雙雜合突變。GJB3基因位于1p33～35，編碼縫隙連接蛋白31，屬于常染色體隱性或顯性遺傳[10]。本研究篩查發(fā)現(xiàn)18例GJB3基因雜合突變，該突變均關(guān)聯(lián)常染色體顯性遺傳，通常起病于青少年期或成人期，一般表現(xiàn)為進(jìn)行性高頻聽(tīng)力受損，少數(shù)患者表現(xiàn)為中重度耳聾[10，11]。線粒體耳聾相關(guān)基因?qū)儆谀赶颠z傳，突變者本人與母系成員均應(yīng)禁用氨基糖苷類藥物，避免發(fā)生藥物性耳聾[12]。目前線粒體耳聾相關(guān)基因研究最多的為線粒體12SrRNA的1555A>G和1494C>T位點(diǎn)。我們?cè)谶@兩個(gè)位點(diǎn)基礎(chǔ)上增加4個(gè)基因的6個(gè)位點(diǎn)，共檢出46例(攜帶率0.76%)線粒體耳聾基因單雜合突變，5例雙雜合突變。MT-RNR1 1555A>G突變共有31例，突變攜帶率0.512%，其主要引起藥物性非綜合征型母系遺傳性耳聾，為雙側(cè)性，程度不等，與氨基糖苷類藥物有關(guān)，關(guān)鍵在預(yù)防[13～17]。對(duì)以上篩查新生兒追蹤隨訪，顯示對(duì)聲音反應(yīng)較好，囑家長(zhǎng)注意定期監(jiān)測(cè)患兒聽(tīng)力，避免藥物性耳聾等。聽(tīng)力異?；純憾@基因攜帶者占66.67%，提示有一部分新生兒雖然攜帶耳聾基因，但現(xiàn)階段對(duì)聲音反應(yīng)較好，與臨床表現(xiàn)不符，可能與環(huán)境因素、遺傳特質(zhì)、藥物性、遲發(fā)性等有關(guān)，而關(guān)鍵在預(yù)防[17]。

比較全國(guó)其他地區(qū)，如長(zhǎng)治地區(qū)、北京市海淀區(qū)、珠海地區(qū)等，臨淄地區(qū)篩查的18個(gè)耳聾基因的100個(gè)位點(diǎn)，除常見(jiàn)4個(gè)耳聾基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)外，我們發(fā)現(xiàn)以下基因位點(diǎn)突變攜帶率相對(duì)較高，如GJB2基因c.257C>G 10例(攜帶率0.165%)，SLC26A4基因c.919-18T>G 12例(攜帶率為0.198%、有1例雙雜合突變)、c.697G>C 10例(攜帶率0.165%)，MT-CO1基因m.7444G>A 9例(攜帶率0.149%)?？赡苡捎诤Y查的位點(diǎn)較多，臨淄地區(qū)新生兒耳聾基因突變總攜帶率為6.67%，高于其他地區(qū)[15～17]。

總之，高通量測(cè)序技術(shù)以其全面、快速、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)，在耳聾基因檢測(cè)方面具有廣闊的前景。利用高通量測(cè)序技術(shù)篩查新生兒耳聾基因突變，檢測(cè)位點(diǎn)多，檢出比率較高，可預(yù)防的對(duì)象多，能夠盡早對(duì)患兒進(jìn)行干預(yù)。對(duì)于耳聾基因突變攜帶者建議健康用耳，避免使用耳毒性藥物，再婚育時(shí)配偶需行耳聾基因檢測(cè)[14，15，17]。同時(shí)對(duì)孕婦進(jìn)行耳聾基因篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)耳聾缺陷，避免聾兒出生。另外，通過(guò)大規(guī)?；蚝Y查，可以建立本地區(qū)耳聾基因突變位點(diǎn)的分布和發(fā)病情況預(yù)測(cè)模型，對(duì)耳聾防控有實(shí)際意義[16]。以上研究數(shù)據(jù)也將為全國(guó)其他地區(qū)耳聾基因篩查提供參考。