多重耐藥鮑曼不動桿菌中ponA表達及其對碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)反應(yīng)觀察

魏星，游德紅，鄭蘭，龐博，余爽，陳思，龔大彩，徐革

1成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院，成都611730；2彭州市中醫(yī)院

多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)是臨床最常見的耐藥菌之一，其耐藥機制主要包括碳青霉烯酶的產(chǎn)生、膜孔蛋白丟失或表達降低、藥物外排泵活性增加和青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變等[1]。對鮑曼不動桿菌耐藥機制的研究中，PBPs改變導(dǎo)致細菌耐藥的相關(guān)研究較少。PBPs是細菌肽聚糖合成過程中的重要蛋白質(zhì)，在細菌細胞壁合成過程中起關(guān)鍵作用。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物因與天然D-丙胺酰-D-丙胺酸的結(jié)構(gòu)相似，可通過共價鍵與PBPs中的活性位點結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)糖基酶和轉(zhuǎn)肽酶活性，進一步抑制肽聚糖的合成，導(dǎo)致細菌細胞壁破壞，將細菌殺死[2]。細菌PBPs結(jié)構(gòu)及數(shù)量的改變是其產(chǎn)生耐藥的重要因素。鮑曼不動桿菌含有7種PBPs[3](PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3、PBP5/6、PBP6、PBP7)，其中ponA編碼的PBP1a蛋白主要功能是維持細胞形態(tài)，是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用的主要靶點之一。研究發(fā)現(xiàn)，ponA基因位點突變可以改變抗生素作用靶點，導(dǎo)致細菌對抗菌藥物敏感性降低而產(chǎn)生耐藥[4]。目前，有關(guān)ponA在鮑曼不動桿菌耐藥中作用的研究較少。2018年6～12月，本研究觀察了MDR-AB中ponA表達情況，及ponA對三種碳青霉烯類抗生素(亞胺培南、美羅培南、多尼培南)誘導(dǎo)的反應(yīng)，從基因水平對PBPs改變導(dǎo)致細菌耐藥的機制進行初步了解，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要實驗材料

1.1.1 菌株來源 收集2018年6～12月成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院臨床分離的MDR-AB，剔除重復(fù)菌株，共19株。其中13株來源于痰液、2株來源于血液、2株灌洗液、1株來源于分泌物、1株來源于尿液。19株菌對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為47.37%。未發(fā)現(xiàn)對多黏菌素B耐藥的菌株(見表1)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 主要實驗材料 亞胺培南、美羅培南、多尼培南購于北京索萊寶科技有限公司，總RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTMRT reagent Kit購于大連TaKaRa公司。PCR儀器為上海宏石SLAN-48P/96S全自動定量PCR儀，菌株鑒定及藥敏試驗采用美華MA120微生物鑒定及藥敏分析儀，電泳儀購于北京六一儀器廠，凝膠成像儀購自上海復(fù)日科技有限公司。

1.2 MDR-AB中ponA基因表達及突變觀察

1.2.1 基因表達檢測 將菌株取出，劃線培養(yǎng)于巧克力平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，第2天挑取單菌落于含200 μL無菌超純水的離心管中，用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶技術(shù)有限公司)按說明書步驟提取細菌DNA。ponA基因長度約2 500 bp，采用分段PCR擴增的方法。通過Genbank和NCBI查找鮑曼不動桿菌ponA基因序列，由上海生工公司合成引物序列。ponA-1上游引物序列為5′-CTCACTTCCGATGGGATTCTA-3′，下游引物序列為5′-TTGATGGTAGAACCTGGCTGA-3′，產(chǎn)物長度1 320 bp；ponA-2上游引物序列為5′CAAATGAAGCTAAAACTGCGTG-3′，下游引物序列為5′-AGGTGTTGTCTTGGAAGGAATC-3′，產(chǎn)物長度1 265 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3～5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55～60 ℃ 25～30 s，延伸72 ℃ 30～50 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物取5 μL的1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳參數(shù)：150 V，100 mA，10～20 min。

表1 19株MDR-AB耐藥情況

1.2.2 基因測序分析 將目的PCR條帶切膠回收，送上海生工公司進行測序分析(3730XL測序儀，美國ABI公司)。根據(jù)所測得基因序列，經(jīng)用DNAMAN軟件拼接成ponA基因全長序列，通過Chromas軟件讀取，作BLAST Search比對。對照抗生素敏感株(SDF)為鮑曼不動桿菌SDF(NC_010400.1)，ponA基因序列下載自基因組數(shù)據(jù)庫(www.biocyc.org)。

1.2.3 耐藥菌株與SDF ponA編碼蛋白結(jié)構(gòu)比較 將耐藥株與SDF ponA基因翻譯的氨基酸序列遞交給Swiss-Model Workplace進行同源建模(模板為PDB.3udi亞單位)，用分子可視化工具軟件Swiss-Pdb Viewer4.0作結(jié)構(gòu)相似性分析。

1.3 碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)后MDR-AB的ponA基因表達及突變觀察

1.3.1 碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo) 將冷凍保存的19株耐藥菌株解凍后轉(zhuǎn)入5 mL的營養(yǎng)肉湯中置于35 ℃過夜復(fù)蘇，肉湯接種于哥倫比亞血瓊脂平板(CBA)，于35 ℃培養(yǎng)18～24 h，待生成典型的“珍珠樣”菌落。從CBA平板上挑取單個菌落洗脫至10 mL的LB液體培養(yǎng)基中35 ℃振蕩培養(yǎng)16～18 h至對數(shù)生長期，取菌液5 mL轉(zhuǎn)入12孔細菌培養(yǎng)板中。分別加入碳青霉烯類抗生素(亞胺培南、美羅培南、多利培南)誘導(dǎo)，調(diào)整抗生素最終濃度為1 mg/L，誘導(dǎo)時間1 h。將菌液吸入離心管，15 000 r/min離心10 min棄去上清液，收集細菌。

1.3.2 ponA檢測 采用qRT-PCR法檢測誘導(dǎo)前后MDR-AB中的ponA mRNA。將誘導(dǎo)前后的菌液使用生理鹽水制成懸液，使用比濁儀調(diào)節(jié)濁度至2 McF。按試劑盒操作說明書提取菌株RNA。取模板5 μL加入反應(yīng)體系及引物，總體積為20 μL，在PCR儀上進行擴增。內(nèi)參基因為16s RNA，上游引物序列為5′-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3′，下游引物序列為5′-CGTAAGGGCCATGATGACTT-3′。反應(yīng)條件為42 ℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃收集熒光8 s，共設(shè)定35個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.3.3 ponA基因測序 提取細菌DNA，通過PCR擴增、瓊脂糖電泳檢測、膠回收等步驟，對擴增的PCR產(chǎn)物進行測序，委托上海生工公司完成。測序結(jié)果以DNAman軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 MDR-AB中ponA基因表達及突變情況

2.1.1 基因表達情況 19株菌均表達ponA基因。部分菌株凝膠電泳結(jié)果見圖1、2。

注：1～9泳道分別為編號1～9菌株。

注：1～9泳道分別為編號1～9菌株。

2.1.2 基因測序分析結(jié)果 ponA基因測序結(jié)果與Genbank中ATCC 17978標準菌株ponA(登錄號為CP000521.1)序列進行比較，結(jié)果顯示98%同源(圖3)。

圖3 ponA基因測序結(jié)果(部分)

2.1.3 ponA編碼蛋白構(gòu)象分析結(jié)果 19株MDR-ABponA基因序列基本一致，選取菌株MDR-AB-1為研究對象，將MDR-AB-1株的ponA基因序列翻譯成氨基酸序列，與SDF株序列相比較，發(fā)現(xiàn)存在4處氨基酸變異，為第23位絲氨酸>丙氨酸、第47位丙氨酸>天冬氨酸、第110位異亮氨酸>亮氨酸、第128位谷氨酸>天冬氨酸。將翻譯成的氨基酸序列遞交給Swiss-Model Workplace進行同源建模，Swiss-Pdb Viewer4.0軟件分析顯示，MDR-AB-1菌株ponA編碼蛋白的空間結(jié)構(gòu)(深色)與SDF菌株(淺色)存在明顯差異(圖4)。

2.2 碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)后MDR-AB的ponA基因表達及突變情況 亞胺培南組、美羅培南組、多尼培南組和未處理組ponA基因相對表達量分別為0.56±0.13、0.78±0.15、0.72±0.21、1.02±0.01，亞胺培南組、美羅培南組、多尼培南組ponA基因相對表達量均低于未處理組(P均<0.05)。用DNAMAN軟件對碳青霉烯誘導(dǎo)前后的菌株ponA基因測序序列進行比對分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有基因突變菌株。

圖4 MDR-AB-1株與SDF株ponA編碼蛋白構(gòu)象比較

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種臨床常見的革蘭陰性菌，在我國各級醫(yī)院臨床標本中的分離率逐年增加。鮑曼不動桿菌不僅對多種青霉素類及頭孢菌素類抗生素天然耐藥，而且在使用敏感藥物治療過程中極易產(chǎn)生獲得性耐藥，導(dǎo)致可用于臨床治療的抗生素種類越來越少。根據(jù)近年相關(guān)文獻報道，鮑曼不動桿菌對包括碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎所有抗生素耐藥率均保持上升趨勢，對常用青霉素類及頭孢類抗生素耐藥率為80%～99%，對碳青霉烯類及一些新型復(fù)合制劑耐藥率也在20%～50%，僅對多黏菌素及米諾環(huán)素有較敏感(耐藥率在10%以下)。2017年CHINET結(jié)果顯示，鮑曼不動桿菌碳青霉烯類藥物耐藥率為70.5%，在有些省份甚至大于80%[5]。

PBPs是位于細菌細胞膜上的膜蛋白，具有轉(zhuǎn)肽酶、羧肽酶和轉(zhuǎn)糖基酶活性，參與細菌肽聚糖生物合成的末端反應(yīng)、形態(tài)維持和糖肽結(jié)構(gòu)的調(diào)整等功能，在細菌生長繁殖過程中起重要作用[6,7]。根據(jù)它們在SDS-PAGE中的分子質(zhì)量、氨基酸序列及細胞功能分為兩組[8]，即高分子量(HMM)和低分子量(LMM)的PBP。而HMM PBP又可分為A型和B型，A型是一類具有雙重酶活性的PBPs，其N末端具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，C末端具有肽基轉(zhuǎn)移酶的活性；B型僅具有肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，但其一定程度上可以維持細胞形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類抗生素主要與HMM PBPs結(jié)合而抑制酶活性從而殺死細菌[9,10]。

鮑曼不動桿菌PBPs表達異常是其產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一[11～13]。目前的研究顯示，鮑曼不動桿菌含有7種PBPs，與耐藥相關(guān)的主要是PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3[3,14]。PBPs介導(dǎo)鮑曼不動桿菌耐藥的機制主要有兩個方面，一是PBPs編碼基因突變導(dǎo)致與β-內(nèi)酰胺類的親和力降低，二是編碼PBPs的基因表達下調(diào)[15]。PBP1a作為β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用的靶點之一，在鮑曼不動桿菌耐藥機制中研究較少。本課題通過對鮑曼不動桿菌PBP1a編碼基因ponA進行研究，發(fā)現(xiàn)19株MDR-AB均攜帶ponA基因，檢出率100%。19株菌ponA基因測序發(fā)現(xiàn)，與SDF株相比，其翻譯氨基酸序列有4處存在差異，即第23位絲氨酸>丙氨酸、第47位丙氨酸>天冬氨酸、第110位異亮氨酸>亮氨酸、第128位谷氨酸>天冬氨酸。Swiss-Model Workplace同源建模更直觀地反映出耐藥株與SDF株P(guān)BP1a蛋白空間結(jié)構(gòu)存在差異。這說明，MDR-AB的PBP1a結(jié)構(gòu)與SDF株不同，這可能是其耐藥的一個重要因素。

近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)，不同種類抗菌藥物在亞MIC濃度可影響細菌生物特性變化，包括耐藥性、毒力、運動力及生物膜形成等，最終使細菌的適應(yīng)性更強[16,17]。由于在抗感染治療過程中，體內(nèi)抗菌藥物分布不同，藥物濃度在亞MIC的階段不可避免，加上臨床高MIC值的耐藥菌(如MDR-AB)的大量出現(xiàn)，使得抗菌藥物處于亞MIC的時間更長，細菌更容易產(chǎn)生高耐藥。本實驗中19株菌在亞MIC濃度的亞胺培南、美羅培南、多尼培南誘導(dǎo)下，ponA基因表達均不同程度下降。誘導(dǎo)效果以亞胺培南最明顯。現(xiàn)已證實亞胺培南能夠在體外誘導(dǎo)鮑曼不動桿菌PBP基因(ponA、ftsI、dacC)異常表達[18]，本實驗進一步證明美羅培南、多尼培南也能誘導(dǎo)ponA表達下調(diào)。三種碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)效果不同，可能是因為各自分子結(jié)構(gòu)不同、主要靶點不同導(dǎo)致[19]。此前，有學(xué)者[20]通過對使用抗生素時間較長的肺炎鏈球菌PBP1a的序列和晶體結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，PBP1a存在突變熱點，此突變可導(dǎo)致PBP1a活性位點的極性和可達性改變。但是，本實驗中19株MDR-AB在碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)后并沒有發(fā)現(xiàn)ponA基因突變，可能是本實驗抗菌藥物誘導(dǎo)時間不夠長或碳青霉烯類誘導(dǎo)僅對ponA基因表達有影響，這需要進一步實驗論證。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)，MDR-AB攜帶ponA基因，ponA編碼氨基酸序列及蛋白構(gòu)象均與SDF存在明顯差異。亞MIC濃度碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)可導(dǎo)致MDR-AB中ponA表達下調(diào)，細菌適應(yīng)性增強，耐藥性增加。臨床治療鮑曼不動桿菌感染過程中應(yīng)盡量避免亞MIC濃度的碳青霉烯類抗菌藥物的暴露，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。