密蒙花中4種成分的含量測(cè)定及其主成分、偏最小二乘判別分析

汪海斌，張楠楠，洪穩(wěn)穩(wěn)，李 芳，閆 攀，黃艷梅

(1.國(guó)家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽 亳州 236800；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800)

密蒙花為馬錢科醉魚草屬植物密蒙花(BuddlejaofficinalisMaxim.)的干燥花蕾及花序[1]，又名黃飯花、小錦花、染飯花等，中國(guó)西南及中南等地多有分布[2]。該藥始載于宋代，《開寶本草》云：“主青盲膚翳，赤澀多淚，消目中赤脈，小兒麩痘及疳氣攻眼?！泵苊苫ㄊ莻鹘y(tǒng)中藥中重要的眼科用藥，具有疏風(fēng)清熱、養(yǎng)肝明目、退翳的功效，常用于目赤腫痛、多淚羞明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花等癥[3-6]。

密蒙花主要活性成分包括黃酮類和苯乙醇苷等類化合物[7-10]。其中，黃酮類化合物具有降血脂、保肝、抗炎等作用，其分離鑒定出的黃酮類化合物以芹菜素、蒙花苷和木犀草素為主；苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，目前密蒙花分離得到的18種苯乙醇苷類化合物中，毛蕊花糖苷為含量最高的成分。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》僅以蒙花苷的含量作為密蒙花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但密蒙花化學(xué)成分復(fù)雜，且不同產(chǎn)地間存在質(zhì)量差異[11-12]，僅僅靠單一成分的含量測(cè)定難以全面反映密蒙花的質(zhì)量?jī)?nèi)涵。因此本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定密蒙花中毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素4種成分含量的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)方法，并借助統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用多元數(shù)據(jù)分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[13]，以期為不同產(chǎn)地密蒙花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters UPLC ACQUITY H-Class型UPLC儀、四元溶劑管理器、SM-FTN樣品管理器、柱溫箱、光二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站、ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)：美國(guó)waters公司；KQ-205 型數(shù)控超聲清洗器：昆山超聲儀器有限公司；AX224ZH萬分之一天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；MSE225S-OCE-DU十萬分之一天平：德國(guó)Sartorius公司；Milli Q型超純水凈化系統(tǒng)：美國(guó) Millipore 公司。

1.2 試藥 密蒙花藥材由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定為馬錢科醉魚草屬植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾及花序；毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201713，純度92.5%)、蒙花苷(批號(hào)111528-201710，純度96.6%)、木犀草素(批號(hào)111520-201605，純度99.6%)、芹菜素(批號(hào)111901-201603，純度92.5%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜級(jí)磷酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量，分別加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.822、1.097、0.563、0.535 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取以上4種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成一定濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度系統(tǒng)(0～2 min，5%→35% A；2～6 min，35% A；6～8 min，35% →50% A；8～10.5 min，50%→100% A；10.5～15 min，100%→5% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：0.15 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣容積2.0 μL。色譜圖見圖1。

注：1.毛蕊花糖苷；2.蒙花苷；3.木犀草素；4.芹菜素

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成6個(gè)質(zhì)量濃度系列的混合對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍。結(jié)果見表1。

表1 4種成分的線性關(guān)系和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液在“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值分別為0.52%、0.57%、0.36%、0.39%，均小于2.0%，表明儀器精密性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S17批密蒙花藥材，按“2.2”下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，測(cè)得各成分含量，計(jì)算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD值分別為0.71%、0.63%、0.66%、0.58%，均小于2.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S17批密蒙花藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h 后按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面積的RSD分別為0.98%、0.89%、0.86%、0.71%，均小于2.0%，結(jié)果表明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的密蒙花粉末(S17)6份，每份0.2 g，分別加入毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.0、2.5、0.16、0.24 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的回收率分別為100.57%、101.76%、99.82%、98.55%；RSD分別為1.22%、1.18%、0.95%、1.39%。

2.5 樣品含量測(cè)定 通過對(duì)24批密蒙花藥材進(jìn)行色譜分析，測(cè)定密蒙花樣品中毛蕊花糖苷、蒙花苷、木犀草素和芹菜素含量，含量測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可以看出，4個(gè)產(chǎn)地密蒙花中毛蕊花糖苷、蒙花苷、芹菜素、木犀草素含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(毛蕊花糖苷：F(3，20)=19.748，P=0.000；蒙花苷：F(3，20)=13.708，P=0.000；芹菜素：F(3，20)=61.693，P=0.000；木犀草素：F(3，20)=10.991，P=0.000)。其中，湖北五峰縣毛蕊花糖苷和蒙花苷的含量最高；陜西旬陽(yáng)縣芹菜素含量最高，木犀草素含量最低；四川金堂縣木犀草素含量最高，芹菜素含量最低；云南姚安縣毛蕊花糖苷和蒙花苷的含量都較低。

2.6 主成分分析(principal component analysis，PCA) 將24批次密蒙花樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，進(jìn)行PCA研究，見表3。前2個(gè)主成分的特征值均大于1，其中第1主成分(PC1)特征值為2.718，方差貢獻(xiàn)率為54.461%；第2主成分(PC2)特征值為1.320，方差貢獻(xiàn)率為33.009%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.470%。結(jié)果說明前2個(gè)因子在反映4種不同產(chǎn)地密蒙花與4個(gè)成分的相互關(guān)系中起主導(dǎo)作用，能夠評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地密蒙花的品質(zhì)。PC1主要反映來自蒙花苷(0.598)的信息；PC2主要反映來自毛蕊花糖苷(0.693)的信息。

表2 不同產(chǎn)地密蒙花中4種成分含量比較

表3 主成分矩陣

上述結(jié)果表明，通過PCA降維處理后所提取的主成分能夠代表密蒙花4個(gè)成分的主要信息。根據(jù)24批密蒙花樣品的PCA結(jié)果，提取前2個(gè)主成分作得分圖，見圖2。由圖2可知，4個(gè)產(chǎn)地的藥材在主成分空間的分布上有各自的特定區(qū)域，湖北五峰縣與陜西旬陽(yáng)縣密蒙花較接近，云南姚安縣與四川金堂縣密蒙花較接近，可能是由于受地理、氣候等因素影響，其化學(xué)成分的富集也有所不同。

圖2 24批樣品PCA得分圖

圖3 4個(gè)化學(xué)成分對(duì)藥材分組的VIP 值

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用光二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，考察不同吸收波長(zhǎng)下各待測(cè)成分的圖譜響應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷在330 nm波長(zhǎng)處紫外吸收較大，蒙花苷的最大紫外吸收為333 nm，木犀草素的最大紫外吸收為350 nm，芹菜素的最大紫外吸收為338 nm，4種活性成分在330 nm波長(zhǎng)時(shí)均有較強(qiáng)的紫外吸收，故最終確定330 nm為本研究4種活性成分含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的選擇 本研究選用4個(gè)不同系統(tǒng)的流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-1%冰醋酸進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)考察了各系統(tǒng)不同組成比例的流動(dòng)相對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各個(gè)指標(biāo)成分出峰時(shí)間適中，各成分間分離度良好，故確定以此為最終的流動(dòng)相。

3.3 不同產(chǎn)地密蒙花藥材中4種成分含量的差異 密蒙花作為一種常用眼科中藥，其藥材的質(zhì)量直接影響到制劑的質(zhì)量與療效，而不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量差異往往較大，因此評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地密蒙花藥材質(zhì)量，優(yōu)選產(chǎn)地也是保證密蒙花相關(guān)制劑質(zhì)量的重要手段之一。PCA和PLS-DA結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材樣品中4種化學(xué)成分的含量具有較大差異，湖北五峰縣密蒙花中毛蕊花糖苷和蒙花苷含量較高，陜西旬陽(yáng)縣密蒙花中芹菜素含量較高，四川金堂縣密蒙花中木犀草素含量較高，芹菜素含量較低。VIP分析篩選出毛蕊花糖苷和芹菜素為分類標(biāo)志物，這2個(gè)化學(xué)成分可有效區(qū)分不同產(chǎn)地密蒙花樣品，即湖北五峰縣密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分別為24.25～27.46 mg/g、0.43～0.57 mg/g，云南姚安縣密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分別為12.45～19.44 mg/g、0.35～0.49 mg/g，陜西旬陽(yáng)縣密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分別為3.81～20.22 mg/g、0.58～0.78 mg/g，四川金堂縣密蒙花中毛蕊花糖苷和芹菜素的含量分別為13.98～23.49 mg/g、0.25～0.34 mg/g。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于密蒙花藥材中4種成分含量的同時(shí)測(cè)定；不同產(chǎn)地的密蒙花藥材質(zhì)量差異較大。