木霉P3.9菌株對枇杷根際土著細(xì)菌數(shù)量的影響

魯海菊 李麗莎 謝欣悅

摘要：以枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株為供試菌株，用稀釋涂布平板法與種群密度法，檢測木霉P3.9菌株對枇杷根際土著細(xì)菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明，在5～25 d期間，以5 d為周期處理組細(xì)菌數(shù)量前10 d呈減增變化，后10 d細(xì)菌數(shù)量持續(xù)減少。對照組細(xì)菌數(shù)量前5 d減少，10～15 d期間保持穩(wěn)定，后5 d增加。木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤 20～80 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量變化趨勢與對照組完全一致，其中在20～50 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量波動幅度大于對照組。80～90 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量變化趨勢與對照組相反。將木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤3個月內(nèi)，處理組細(xì)菌數(shù)量明顯高于對照，木霉P3.9菌株可促使枇杷根際土壤細(xì)菌數(shù)量增加。

關(guān)鍵詞：枇杷;木霉;根際土著細(xì)菌;根際土壤;細(xì)菌數(shù)量

中圖分類號： S436.67+9 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0089-03

收稿日期：2019-06-30

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31660147）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（編號：2016FB066）;紅河學(xué)院應(yīng)用型科學(xué)研究重點項目（編號：XJY15Z06）。

作者簡介：魯海菊（1978—），女，云南大理人，博士，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。 ?枇杷（Eriobotrya japonica）為常綠小喬木，可藥食兩用[1-2]，是云南蒙自地方特色水果之一。由于枇杷種植面積不斷擴大，病害日趨嚴(yán)重[3]。據(jù)文獻(xiàn)記載，蒙自枇杷有5種常見病害，分別為圓斑病、灰斑病、角斑病、炭疽病、根腐病[4]，其中根腐病作為土傳病害最為嚴(yán)重，具體表現(xiàn)為葉片變黃脫落，莖干呈褐色，基部腐爛，嚴(yán)重時整株死亡，發(fā)病率超過40%，嚴(yán)重阻礙了枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。曾嘗試用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑防治手段控制此病害，但其效果不理想。因此，生物防治成為防治枇杷根腐病的有效方法之一。木霉（Trichoderma spp.）在植物土傳病害防治中已占90%以上，可用于防治植物葉部和根部病害[5]，抑制多種植物病原真菌[6]，曾與化學(xué)農(nóng)藥混配有效控制獼猴桃軟腐病[7]。魯海菊等分離出1株源自枇杷主干的木霉P3.9菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株抗菌譜廣[8]、對根際土壤真菌[9]及枇杷內(nèi)生真菌[10]有抑制作用，且其發(fā)酵工藝簡單[11]，對枇杷植株有促生作用，能定殖于枇杷根際土壤及其植株各個器官[12]，開發(fā)利用前景廣闊。

研究發(fā)現(xiàn)，在甜瓜[13]、黃瓜[14-15]、苜蓿[16]、草坪[17]、辣椒[18]根際中引入木霉會引起細(xì)菌數(shù)量在一定時間內(nèi)增加或減少，同時木霉對土壤微生態(tài)有調(diào)節(jié)作用甚至能與植物共生。土著細(xì)菌作為土著微生物成員之一，直接關(guān)系到植株生長，陳立華指出木霉能使土著細(xì)菌數(shù)量增加，病原菌數(shù)量減少[19]。為探明木霉P3.9菌株對枇杷根際土著細(xì)菌數(shù)量有無類似的影響，本研究用稀釋涂布平板法[20]測定木霉P3.9菌株對枇杷土著真菌數(shù)量的影響，以期為其防治枇杷根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生木霉（Trichoderma atroviride）P3.9菌株分離自枇杷主干韌皮部，保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)標(biāo)本室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL 自來水，pH值自然。

營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值自然。

上述培養(yǎng)基配好后均在121 ℃高壓滅菌 30 min。材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌懸液接種根際土壤的方法 將試管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落長滿培養(yǎng)皿后，用打孔器取5 mm的菌餅，接入PDA平板中央。共培養(yǎng)5皿，置溫度為28 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d;待菌落長滿培養(yǎng)皿后，收集所有培養(yǎng)物至粉碎機，并加入適量無菌水，充分打勻，制成菌懸液，調(diào)整孢子液濃度至1×106 CFU/mL備用。將枇杷嫁接苗種植于營養(yǎng)袋（23 cm×18 cm）中，苗齡為1年時做接種試驗。用上述木霉孢子懸浮液灌根500 mL/株，灌根等量清水作為對照，設(shè)10次重復(fù)，常規(guī)肥水管理。

1.2.2 枇杷根際土壤細(xì)菌菌懸液的制備 在灌根木霉孢子懸浮液5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 d時，用高為0.5 m，鉆頭直徑為38 mm的取樣不銹鋼環(huán)刀土鉆;處理和對照枇杷苗分別隨機取5株，每株用5點取樣法，采集深度為5～20 cm的根際土樣，用四分法充分混勻土樣備用。處理和對照各稱1 g根際土樣置于裝有 99 mL 無菌水的三角瓶中，在振蕩儀器上以 200 r/min 振蕩20 min，配制成10-1懸液，靜置 2 min，用無菌微量移液器吸取1 mL，加入到9 mL無菌水中即為10-2稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3～10-8的稀釋液。

1.2.3 枇杷根際細(xì)菌測定 取100 μL 10-8土壤稀釋懸浮液，采用傾注法加入平板培養(yǎng)基中，設(shè)5次重復(fù)。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后計數(shù)平皿上的細(xì)菌菌落，計算根際細(xì)菌種群密度。

依照以上方法統(tǒng)計施入木霉孢子懸浮液5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 d時，根際細(xì)菌的數(shù)量變化情況，計算菌落數(shù)，計算公式為種群密度（CFU/g）=每個培養(yǎng)皿中菌落平均值×稀釋倍數(shù)×10×水分系數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行匯總，采用平均值計算與作圖，所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～40 d細(xì)菌數(shù)量變化

由表1可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～40 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量前5 d減少，其他時間以15 d為周期呈循環(huán)增減變化，前5 d增加，后10 d減少。對照組細(xì)菌數(shù)量前5 d減少，10～15 d數(shù)量保持穩(wěn)定，15～35 d期間以10 d為周期呈循環(huán)增減變化， 35～40 d期間細(xì)菌數(shù)量減少。處理組細(xì)

2.2 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤40～65 d細(xì)菌數(shù)量變化

由表2可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤40～65 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律與對照組一致。前10 d細(xì)菌數(shù)量先增后減，之后10 d增加，最后5 d減少。除45 d時處理組較其他時期呈現(xiàn)略微的升高外，細(xì)菌數(shù)量變化趨勢相同。處理組細(xì)菌數(shù)量明顯高于對照組。

2.3 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤65～90 d細(xì)菌數(shù)量變化

由表3可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤65～90 d期間，前15 d處理組與對照組細(xì)菌數(shù)量變化一致，呈增減增的變化趨勢。后10 d處理組細(xì)菌數(shù)量呈先增后減的變化趨勢，對照組細(xì)菌數(shù)量呈先減后增的變化趨勢。處理組細(xì)菌數(shù)量明顯高于對照組。

2.4 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～90 d細(xì)菌數(shù)量變化

5～20 d期間，以5 d為周期處理組細(xì)菌數(shù)量前10 d呈減增變化，15～25 d細(xì)菌數(shù)量持續(xù)減少。對照組細(xì)菌數(shù)量前5 d減少，10～15 d期間保持穩(wěn)定，15～20 d增加。處理組細(xì)菌數(shù)量波動幅度大于對照組。在20～80 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量變化趨勢與對照組基本一致，其中，在20～50 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量波動幅度大于對照組。在80～90 d期間，處理組細(xì)菌數(shù)量變化趨勢與對照組相反。3個月內(nèi)處理組細(xì)菌數(shù)量明顯高于對照組。

3 結(jié)論與討論

木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～90 d期間，能促進(jìn)枇杷根際細(xì)菌數(shù)量增加，在15 d達(dá)到最大值，為1.14×1010 CFU/g。本研究結(jié)果與尹丹韓等報道的結(jié)果[14，17，21-22]一致。尹淑麗等報道，黃瓜根圍接種木霉對細(xì)菌的數(shù)量影響不明顯[23]。尹丹韓研究證明，黃瓜根圍細(xì)菌的數(shù)量群落變化不受接種木霉菌劑影響[24]。本研究結(jié)果與之不一致。王秋君研究發(fā)現(xiàn)，土壤肥力高，細(xì)菌和真菌數(shù)量多[25]。吳凡等也提出，肥沃土壤根際細(xì)菌、放線菌的數(shù)量多[26]。說明土壤細(xì)菌種群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)與土壤肥力呈正相關(guān)。木霉P3.9菌株能導(dǎo)致枇杷根際細(xì)菌數(shù)量增加，增強土壤肥力，發(fā)揮促進(jìn)枇杷生長的功能[12]，另外，此木霉菌株抗菌譜廣[8]。說明木霉P3.9菌株具有藥肥兩用的功能，應(yīng)用前景廣闊，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李大慶，夏忠敏，楊再學(xué)，等. 余慶縣枇杷病蟲發(fā)生種類及危害情況調(diào)查研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（13）：116-117.

[2]許麗群. 枇杷栽培管理技術(shù)[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2013（33）：171-172.

[3]胡忠榮. 抓住“一帶一路”的發(fā)展機遇促進(jìn)云南高原特色優(yōu)勢水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展[C]//云南省科學(xué)技術(shù)協(xié)會、中共普洱市委、普洱市人民政府. 第七屆云南省科協(xié)學(xué)術(shù)年會論文集——專題二：綠色經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，2017：6.

[4]魯海菊，盧寧強，楊 梅，等. 從枇杷根際土壤真菌中篩選抗其根腐病病菌的菌株[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27（5）：1961-1964.

[5]張樹武，徐秉良，薛應(yīng)鈺，等. 長枝木霉T6菌株對黃瓜南方根結(jié)線蟲的防治及其根際定殖作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2016，27（1）：250-254.

[6]楊萬榮，邢 丹，蓬桂華，等. 木霉菌生物防治辣椒疫病的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（19）：127-129.

[7]胡容平，石 軍，林立金，等. 四川獼猴桃軟腐病防治初步研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，30（2）：366-370.

[8]魯海菊，張建春，杞敬香，等. 枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株抗菌譜研究[J]. 北方園藝，2014（24）：103-107.

[9]沈云玫，張建春，李 河，等. 枇杷根際土壤真菌對生防木霉菌株P(guān)3.9的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：106-108.

[10]魯海菊，張建春，沈云玫，等. 枇杷內(nèi)生真菌對P3.9生防木霉菌株的抑菌作用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（11）：2547-2550.

[11]魯海菊，王 波，潘柳君，等. 深綠木霉P3.9生防菌株固體發(fā)酵條件優(yōu)化篩選[J]. 北方園藝，2014（14）：119-123.

[12]魯海菊，沈云玫，陶宏征，等. 內(nèi)生木霉P3.9菌株的多功能性及其枇杷根腐病的盆栽防效[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，26（11）：1681-1688.

[13]郁雪平，朱偉杰，高觀朋，等. 生防木霉菌Th2和T4對甜瓜根圍土壤微生態(tài)的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2009，36（6）：522-528.

[14]尹丹韓，高觀朋，夏 飛，等. 生防菌哈茨木霉T4對黃瓜根圍土

壤細(xì)菌群落的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（2）：246-254.

[15]李世貴. 兩種木霉菌對黃瓜枯萎病菌生防作用及根際土壤微生物影響研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[16]尹 婷. 深綠木霉T2對微生物種群數(shù)量的影響及抗藥菌株的篩選[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[17]古麗君，徐秉良，梁巧蘭，等. 生防木霉對草坪土壤微生物區(qū)系的影響及定殖能力研究[J]. 草業(yè)學(xué)報，2013，22（3）：321-326.

[18]燕嗣皇，吳石平，陸德清，等. 木霉生防菌對根際微生物的影響與互作[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，18（1）：40-46.

[19]陳立華. 哈茲木霉及其微生物有機肥對黃瓜土傳枯萎病的生物防治及其機理[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[20]沈 萍，范秀容，李廣武. 微生物學(xué)實驗[M]. 北京：高等教育出版社，1999：49-95.

[21]朱雙杰，董麗麗. 哈茨木霉T23和3種土壤有益細(xì)菌的相互作用對白菜生長的影響[J]. 淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，29（2）：44-48.

[22]劉登望. 拌種劑對花生產(chǎn)量、品質(zhì)及根際土壤微生物的影響[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[23]尹淑麗，麻耀華，張麗萍，等. 不同生防菌對黃瓜根際土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性的影響[J]. 北方園藝，2012（1）：10-14.

[24]尹丹韓. 生防菌P.fluorescens 2P24、CPF10、T.harzianum T4對黃瓜根圍土壤細(xì)菌群落的影響[D]. 上海：華東理工大學(xué)，2011.

[25]王秋君. 稻麥輪作系統(tǒng)中施用有機無機復(fù)混肥對作物生長及土壤肥力的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[26]吳 凡，李傳榮，崔 萍，等. 不同肥力條件下的桑樹根際微生物種群分析[J]. 生態(tài)學(xué)報，2008，28（6）：2674-2681.李君君，戴玲玲，顧安樂，等. 30%毒死蜱微膠囊懸浮劑的制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（11）：92-95.