優(yōu)選盆栽小菊高效再生及轉(zhuǎn)化體系的建立

羅宇婷 黃藝清 黃琪

摘要：為篩選最適盆栽小菊品種，建立再生轉(zhuǎn)化體系，以 11 個盆栽小菊品種無菌苗葉片為外植體，比較不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比和抗生素對葉片愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及生根等過程的影響。結(jié)果表明，11 個品種中再生率最高的為微風深紅，其最適分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，再生率為 95.0%;葉片分化對卡那霉素和潮霉素的抗性選擇壓分別為 15、10 mg/L;對植株生根的抗性選擇壓分別為 10、8 mg/L;羧芐青霉素抑菌濃度最適范圍為 200～400 mg/L。本研究建立了盆栽小菊葉片外植體的高效再生及轉(zhuǎn)化體系，為今后菊花的轉(zhuǎn)基因工作奠定良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：盆栽小菊;葉片;不定芽生根;農(nóng)藝性狀;再生;遺傳轉(zhuǎn)化;選擇壓力

中圖分類號：S682.1+10.4+3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0061-06

收稿日期：2019-06-04

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（17）3036];江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（花卉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系綜合示范基地項目（編號：JATS2018002）;青海省科技項目（編號：2018HZ819）;教育部高校科研基地業(yè)務(wù)費項目（編號：KJFP201703）

作者簡介：羅宇婷（1995—），女，四川樂山人，碩士研究生，主要從事觀賞植物育種與栽培技術(shù)研究。E-mail：532969000@qq.com。

通信作者：蔣甲福，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事菊花遺傳育種與分子生物學研究。E-mail：jiangjiafu@njau.edu.cn。 ?菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）在我國有著源遠流長的栽培歷史，至今已培育出各具特色的品種群，發(fā)展成為世界四大切花之一，具有很高的觀賞和經(jīng)濟價值[1]，因而篩選、培育具有優(yōu)良性狀的新品種十分具有實用意義。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過基因工程改良性狀己經(jīng)逐漸成為植物定向遺傳改良的重要手段。由于菊花的品種繁多、遺傳背景復(fù)雜，不同基因型菊花的再生能力也各不相同[2]。研究表明，基因型差異是影響菊花再生的主要因素[3]。Horsch 等在之前的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化試驗中利用葉盤轉(zhuǎn)換法，對多個不同品種的菊花進行再生試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的菊花有著較大差異的遺傳轉(zhuǎn)化率，表明菊花的轉(zhuǎn)化效率依賴于品種[4]。目前，已經(jīng)利用葉片、葉柄、莖段、花器官等外植體實現(xiàn)了不同品種菊花再生和轉(zhuǎn)化體系的建立[5-6]，而應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化最普遍的受體材料是葉片[7]。利用盆栽小菊進行再生及轉(zhuǎn)化體系建立至今未見報道。本研究以 11 個盆栽小菊新品種葉片為外植體，從基因型、6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）激素配比以及抗生素對菊花再生的影響進行系統(tǒng)深入的研究，旨在建立高效再生及轉(zhuǎn)化體系，為盆栽小菊的分子遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為盆栽小菊品種微風深紅、花灑綠色心情、色彩火山、微風橙綠、微風玫瑰、微風索爾、青檸水晶、夢幻粉水晶、紅水晶、微風紅霞和粉色，取自南京農(nóng)業(yè)大學中國菊花種質(zhì)資源保存中心。

1.2 性狀選取與數(shù)量采集

從定植到開花期，對 11 個品種的株高、莖粗、花徑、花型、花色、定植時間、現(xiàn)蕾時間、開花時間這 9 個性狀[8]采用直尺、游標卡尺、目測的方法進行測定，每個品種 10 次重復(fù)。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

以 MS培養(yǎng)基[9]作為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加 30 g/L蔗糖和 6.5 g/L瓊脂，植物生長調(diào)節(jié)劑選用不同濃度比的 6-BA 和 NAA，用 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至5.8，116 ℃高溫高壓滅菌 30 min。培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照度 20～25 lx，每天光照12 h。

1.4 不同基因型葉片外植體再生差異

挑選 3 個具有代表性的、含不同濃度比 6-BA 和 NAA 的分化培養(yǎng)基M2、M5、M7 （表 1）對 11 個品種進行初步篩選[10]。從中挑選出再生率高的6個品種，使用9個不同濃度配比6-BA和NAA的分化培養(yǎng)基 M1～M9 （表1）對其細篩選。各品種每個培養(yǎng)基接種 30 個葉盤，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計再生率，不定芽再生率=再生不定芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.5 卡那霉素和潮霉素篩選濃度的確定

1.5.1 葉片外植體分化 以篩選出的品種為材料，將葉片接種于含不同濃度梯度的卡那霉素（Km）和潮霉素（Hyg）的最適分化培養(yǎng)基上，Km 和 Hyg設(shè)置 0、5、10、15、20、25 mg/L 6 個濃度處理，每個處理接種 30 個外植體，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計分化情況。

1.5.2 不定芽生根 以篩選出的品種為材料，將不定芽接種于含不同濃度梯度的 Km 和 Hyg 的生根培養(yǎng)基上，Km 和 Hyg設(shè)置為 0、5、8、10、12、15 mg/L 6 個濃度處理，每個處理接種10 個外植體，3 次重復(fù)。15 d 后統(tǒng)計生根情況。

1.6 羧芐青霉素抑菌濃度的確定

將生長狀況一致的葉片外植體用無菌手術(shù)刀切成約 5 cm × 5 cm 大小的葉盤，在最適分化培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3 d，用農(nóng)桿菌侵染 7 min 后將多余菌液吹干，置于最適分化培養(yǎng)基中黑暗共培養(yǎng) 3 d，將葉盤轉(zhuǎn)入含有不同濃度的羧芐青霉素（Cb）培養(yǎng)基中，Cb設(shè)置為 0、200、300、400、500 mg/L 共5個處理，同時以未侵染農(nóng)桿菌的葉盤作為空白對照，每個處理接種 20 個外植體，每個處理3 次重復(fù)。15 d 后統(tǒng)計抑菌情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 11個盆栽小菊農(nóng)藝性狀觀察

對2018 年定植的11個盆栽小菊品種基本性狀進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果（表2）表明，11 個品種的株高在15～58 cm之間，莖粗在4.83～7.89 cm之間;微風索爾的花徑最大，達 10.5 cm，花徑最小的品種是粉色，僅3.5 cm;花色中多為粉色、紅色、黃色;品種粉色從定植到開花的時間最短，為 130 d。

2.2 不同基因型葉片外植體再生差異

在 3 種常用分化培養(yǎng)基上，11 個品種盆栽小菊的葉片外植體分化差異較大，其中微風深紅、微風索爾、微風紅霞、微風玫瑰、粉色、紅水晶都能產(chǎn)生不定芽，但是其他品種夢幻粉水晶、花灑綠色心情、色彩火山、微風橙綠、青檸水晶都出現(xiàn)明顯的褐化現(xiàn)象且不能分化出不定芽。因此，本試驗選擇微風深紅、微風索爾、微風紅霞、微風玫瑰、粉色、紅水晶 6 個品種進行下一步細篩試驗。

Renou等的試驗表明，6-BA 和 NAA 是對菊花再生最佳的植物生長調(diào)節(jié)劑[11]。將 6 種盆栽菊花葉片外植體接種在 9 種含不同配比 NAA 和 6-BA 激素的分化培養(yǎng)基上進行再生率的觀察。從表 3 可以看出，只有品種微風深紅可以在所有不同配比的分化培養(yǎng)基上都分化出不定芽，同一品種在不同的激素濃度處理下分化情況有著較大的差異，當 6-BA、NAA 濃度分別為 1.0、0.2 mg/L 時，再生率最高，可達 95%（表3、圖1）。試驗結(jié)果還可以看出，在同一處理下不同盆栽菊的分化情況也有所不同，其他 5 個品種只能在特定 NAA 和 6-BA 比例的 MS 培養(yǎng)基上產(chǎn)生不定芽。此結(jié)論與李金童等對4種露地菊建立再生體系的試驗結(jié)果[12]一致。因此，在后續(xù)試驗中以微風深紅作為遺傳轉(zhuǎn)化對象，確定其葉片分化培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，其他 5 個品種不作進一步研究。

2.3 卡那霉素和潮霉素篩選濃度的確定

2.3.1 對葉片外植體再生的選擇壓力確定 不同基因型、不同外植體對不同選擇劑甚至同一選擇劑的敏感程度不同，因此須要進行選擇劑濃度的確定。本試驗發(fā)現(xiàn)，抗生素 Hyg 和 Km 對菊花幼葉再生有抑制作用，隨著抗生素濃度的增加，微風深紅葉片外植體再生能力逐漸下降（表 4）。當 Hyg、Km濃度分別為 10、 15 mg/L時， 葉片脫分化率分別為

30%、6.7%，不定芽的分化完全被抑制（圖2、圖3）。由上述結(jié)果可知，10 mg/L Hyg、15mg/L Km為微風深紅葉片外植體再生的臨界耐受濃度，可作為其遺傳轉(zhuǎn)化過程中葉片再生的選擇壓力。

2.3.2 不定芽生根的選擇壓力確定 由表5可知，抗生素 Km 和 Hyg 對微風深紅莖段外植體生根具有抑制作用，且抗生素濃度越大，抑制作用越明顯。當 Km 和 Hyg濃度分別上升為 10、8 mg/L時，莖段外植體的生根能力完全被抑制（圖 4、圖5）。因此，10 mg/L Km、8 mg/L Hyg為微風深紅莖段生根的臨

2.4 羧芐青霉素抑菌濃度的確定

由表6可知，Cb 對農(nóng)桿菌的抑制效果相對明顯。當不添加 Cb 時，經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片外植體農(nóng)桿菌大量繁殖導(dǎo)致植株死亡，葉片不能進行分化，而未經(jīng)侵染的葉片外植體再生率可達 92.9%（圖6）;而隨著 Cb 濃度的増大，葉片周圍產(chǎn)生的菌落逐漸減少，部分外植體傷口邊緣有褐化現(xiàn)象;當 Cb 濃度達到 400 mg/L 時，農(nóng)桿菌生長被完全抑制，無可見菌斑，葉片正常分化，再生頻率可達 89.7%;當Cb 濃度為 500 mg/L 時，雖然抑制了農(nóng)桿菌的生長，但葉盤也受到了毒害，甚至褐化死亡，再生率下降。因此，最適抑菌濃度為 400 mg/L。

3 討論

植物組織培養(yǎng)一直是獲得再生植株和植物基因工程育種的關(guān)鍵步驟之一，對于遺傳轉(zhuǎn)化體系來說，擁有高效的再生率是其必要條件[13]。但菊花的組織培養(yǎng)具有復(fù)雜性和多樣性， 不同品種間再生能

力有很大的差異，激素種類以及配比的不同都對再生有影響[14]。在菊花的離體培養(yǎng)中使用最廣泛的激素為 6-BA 和 NAA[15]，毛洪玉等誘導(dǎo)地被菊中國紅葉片，在 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基上獲得了最高的不定芽分化率[16];梁芳等誘導(dǎo)菊花品種獅子頭葉片，發(fā)現(xiàn)最適的分化培養(yǎng)基為 MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA[17]。吳志蘋等的試驗表明，菊花金不凋愈傷組織不定芽分化的最適培養(yǎng)基為 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，不定芽分化率為 900%[18]。本研究以 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在不同的 6-BA和 NAA 組合下，對 11 個不同基因型盆栽小菊葉片外植體進行再生能

力評估。其中，菊花品種微風深紅的分化能力最強，在 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基中再生頻率高達 95%。結(jié)果表明，不同基因型菊花最適的 6-BA 和 NAA 配比是不同的，基因型是影響外植體高效再生的決定性因素，這與前人的觀點[19]一致。

在使用不同濃度激素配比進行最適再生培養(yǎng)基篩選時，很多葉片會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，組培褐化的發(fā)生與否通常由植物種類及自身基因型決定[20]。本試驗中除微風深紅其他品種均出現(xiàn)褐化且再生率較低，這可能與植物自身的基因型有關(guān)。彭思維等在研究火龍果莖段愈傷組織誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，高濃度的生長調(diào)節(jié)劑噻苯隆（TDZ）會導(dǎo)致植物組織加快分裂，使得愈傷組織來不及吸收營養(yǎng)最終褐化[21]。在進行愈傷誘導(dǎo)時使用不同濃度配比的6-BA 和NAA，隨著6-BA 濃度的升高，褐化品種的葉片褐化率升高。菊花葉片的褐化是與植物自身的基因型有關(guān)，還是與植物生長調(diào)節(jié)劑的類型及濃度使用不當有關(guān)，具體原因須要進一步研究。

菊花的遺傳轉(zhuǎn)化中最常使用的選擇標記抗生素主要是卡那霉素和潮霉素[22]，卡那霉素的使用濃度范圍一般為 5～50 mg/L，潮霉素為 5～20 mg/L[15]。本試驗發(fā)現(xiàn)，微風深紅對 Hyg 比對 Km 更為敏感，當 Hyg 濃度為10 mg/L 時已經(jīng)可以完全抑制其分化，但是 Km 濃度要達到 15 mg/L 時才能起到完全抑制分化的作用。寧云霞用葉盤作為外植體對菊花白安娜分化的 Hyg 濃度進行篩選，發(fā)現(xiàn)8 mg/L Hyg 是菊花葉盤最適的抗性選擇壓力[23]，在本試驗中微分深紅葉盤分化的臨界濃度為 10 mg/L Hyg，這表明不同基因型菊花對 Hyg 的敏感度不同。本試驗中只看到少數(shù)轉(zhuǎn)化后的外植體產(chǎn)生抗性芽，原因之一可能是預(yù)培養(yǎng)的時間不合理，賈紅梅等的研究表明，預(yù)培養(yǎng)時間過長會造成菊花葉片切割處褐化，影響轉(zhuǎn)化的成功率[24];原因之二可能是潮霉素對植物組織有很大的毒害作用，即使是低濃度的潮霉素也會產(chǎn)生很大的毒害作用[25-26]。本試驗在經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后添加 Cb 抑菌，從試驗結(jié)果可以看出，Cb 濃度升高使得不定芽分化受到抑制，這與da Silva發(fā)現(xiàn)的 Cb 對菊花外植體分化不定芽具有一定毒性的結(jié)論[27]一致。因此，抗生素在篩選轉(zhuǎn)化細胞的同時也對細胞有毒害作用，如何減少抗生素的毒害作用、提高轉(zhuǎn)化效率是今后菊花基因工程育種努力的方向。

4 結(jié)論

本研究從11個盆栽小菊品種中篩選出較其他品種有很大再生優(yōu)勢的品種微風深紅，通過葉片外植體建立再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，其最適分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，再生率為 95.0%;葉片分化對 Km 和 Hyg 的抗性選擇壓分別為15、10 mg/L;生根的抗性選擇壓分別為 10、8 mg/L;Cb的最適濃度范圍為 200～400 mg/L。本研究能為今后菊花的轉(zhuǎn)基因工作奠定良好的基礎(chǔ)。

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