生物材料肝素固定化結(jié)合方式專利技術(shù)綜述

鄭瓊娟 薛發(fā)珍

摘要：本文闡述了專利申請(qǐng)中生物材料肝素固定化結(jié)合方式，主要包括物理混合、離子鍵合和化學(xué)鍵合，并對(duì)不同的方法進(jìn)行了比較。對(duì)生物材料領(lǐng)域科學(xué)研究、產(chǎn)業(yè)發(fā)展、專利申請(qǐng)以及審查工作等方面具有一定的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞：生物材料;肝素;固定化;物理混合;離子鍵合;化學(xué)鍵合

中圖分類號(hào)：R973 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2020）09-0080-03

1 引言

肝素的生物學(xué)作用主要是通過與抗凝血酶Ⅲ相互作用，肝素分子含有硫酸化殘基，其允許多糖以高親和力與抗凝血酶結(jié)合，從而加速凝血因子的失活。存在于動(dòng)物體內(nèi)的肝素具有良好的抗凝血作用，但其在體內(nèi)停留的時(shí)間不長，通過固定化可以延長肝素在體內(nèi)的作用時(shí)間，其中肝素固定化就是肝素大分子在生物材料表面上的固定化。通過肝素化來提高生物材料抗凝血性，是公認(rèn)的改進(jìn)生物材料抗凝血性能最好的方法之一。本文統(tǒng)計(jì)了專利申請(qǐng)中肝素固定化生物材料主要的結(jié)合方式：物理混合、離子鍵合和化學(xué)鍵合。

2 物理混合

物理混合主要利用物理包埋作用、分子鏈的纏繞和滲透、多孔材料的吸附作用等原理將肝素固定到生物材料表面。肝素在上述固定化的過程中未發(fā)生任何化學(xué)作用，因此保留了原始構(gòu)象，能夠較好地發(fā)揮抗凝血性能。

常用來與肝素共混的主要是具有較高生物相容性的天然高分子：專利JPH01124465A[1]采用膠原或明膠與肝素進(jìn)行共混成膜，用于人造血管等生物材料的抗凝血用;專利US2003161938A1[2]將低分子量肝素或硫酸乙酰肝素等，與多聚賴氨酸或肽混合進(jìn)行涂層，其中所述肽優(yōu)選具有精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-絲氨酸序列的四肽或者具有精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-賴氨酸序列的四肽，這些肽一方面可以抑制血小板聚集并可提高溶栓治療的功效和效力，另一方面具有很快粘附到表面上的能力，可以顯著減少接觸時(shí)間，以便在醫(yī)療裝置如心臟麻痹單元，氧合器或支架上獲得不可逆涂層;專利CN101879330A[3]將絲素蛋白與肝素制備成混合液，注入復(fù)合體中層的內(nèi)表面，經(jīng)冷凍干燥處理后，在復(fù)合體內(nèi)層形成絲素多孔材料等。

物理混合方法簡(jiǎn)便易行，但由于物理固定具有穩(wěn)定性差和可控性差，故實(shí)用性較低，在三種主要固定方式中占比最低。

3 離子鍵合

離子鍵合是利用正、負(fù)電荷之間的相互作用將帶有負(fù)電荷的肝素固定在生物材料的表面上。由于肝素分子上含有大量的負(fù)電性基團(tuán)：羥基、羧基、磺酸基，具體如圖1所述，可以引入帶正電性的季銨基團(tuán)偶聯(lián)劑或陽離子表面活性劑與肝素發(fā)生靜電吸附，如圖2所示，從而實(shí)現(xiàn)肝素的固定，如GERALD A、GRODE等[4]采用偶聯(lián)劑TDMAC通過兩步法，將偶聯(lián)劑與生物材料進(jìn)行反應(yīng)，從而在生物材料表面上引入陽離子基團(tuán)，再利用季銨根離子與肝素分子的正負(fù)電荷吸附作用，將肝素吸附固定在生物材料上;專利JP2000202031A[5]，將TDMAC與肝素優(yōu)先形成TDMAC化肝素溶液，再利用AC段與生物材料的親和力進(jìn)行結(jié)合;專利JPS4813341B2B1[6]設(shè)計(jì)了一種通過用由肝素和陽離子表面活性劑組成的有機(jī)溶劑可溶的共沉淀材料或包含溶解在有機(jī)溶劑中的這種共沉淀材料和塑料材料的液體組合物涂覆制品而在制品上提供抗凝血表面的方法，然后干燥如此處理的制品，可應(yīng)用于任何與血液接觸的物品，如人工心臟，人工心臟瓣膜等。

離子鍵合還可以合成帶有陽離子基團(tuán)如氨基等的高聚物，再與肝素作用，通過離子鍵合形成肝素涂層。如專利JPS498583A[7]在十二烷基硫醇和溴仿的存在下使丙烯腈和丙烯酸聚合，然后接枝甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，季銨化后吸附肝素形成肝素涂層。

為了進(jìn)一步提高離子鍵合的結(jié)合力，可通過多層離子鍵結(jié)合以固定肝素，如CN1836743A[8]先用芯材材料聚乳酸、或聚乙醇酸及其共聚物、或聚己內(nèi)酯制成多孔的支架，然后用帶有正電荷的殼聚糖或膠原，與帶有負(fù)電荷的硫酸軟骨素或硫酸肝素組裝材料交替按順序一層一層自組裝在多孔支架芯材外層，重復(fù)自組裝步驟直到設(shè)計(jì)的組裝層數(shù)，而后快速冷凍和真空冷凍，即得到多孔、分層、三維空間多級(jí)結(jié)構(gòu)的組織支架材料。

總體而言，離子鍵合較物理混合穩(wěn)定，能夠維持肝素的原始構(gòu)象，最大限度地保留抗凝血效果。但通過離子鍵合多層結(jié)合并不能很好的暴露抗凝血酶結(jié)合序列，導(dǎo)致抗凝血活性不能得到較好發(fā)揮，加之肝素易被血液中其它陰離子置換或因離子鍵的斷裂而快速釋放，使得生物材料表面較快失去抗凝血活性。

4 共價(jià)鍵合

共價(jià)鍵合利用生物材料表面上固有的，或者改性后具有的功能基團(tuán)，如-NH2、-COOH、-NCO、-OH、等基團(tuán)與肝素分子上的-OH、-COOH、-NH或共價(jià)結(jié)合，如專利US2005244453A[9]通過處理包括粘附聚合物和肝素的涂層組合物形成的涂料化合物，其中粘附聚合物和生物相容性藥劑通過光敏部分偶聯(lián)，如使用聚（丁基）甲基丙烯酸酯通過光敏部分與肝素發(fā)生光發(fā)生化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián);或通過交聯(lián)劑如戊二醛、EDC的交聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝素的共價(jià)固定，如EP0352330A1[10]通過交聯(lián)劑碳二亞胺或戊二醛實(shí)現(xiàn)肝素在絲素蛋白上的固定，并可根據(jù)需要進(jìn)行成型，如流延成膜用于制備血液容器等。

相比于離子鍵合，共價(jià)鍵合具有更高的穩(wěn)定性，由此獲得的肝素化生物材料在臨床上可長期使用。然而，更為穩(wěn)固的固定結(jié)構(gòu)，一定程度上反而限制了肝素分子的原始構(gòu)象，導(dǎo)致被固定化肝素分子的生物活性被削弱。相應(yīng)的，其抗凝血性能也受到一定的影響，上述問題是共價(jià)鍵合最大的缺陷。

為了解決共價(jià)鍵合后帶來的肝素活性下降的問題，可通過以下兩種手段進(jìn)行改善：

第一，在生物材料表面與肝素分子之間連接一“空間臂”以增加肝素分子的自由性，如專利JPH09108331A[11]將肝素分子通過與半縮醛部位線性結(jié)合而延伸的尿素結(jié)合和烷基的懸垂支路接枝聚合并固定在生物材料上，構(gòu)成樹枝部分的烷基有3～6個(gè)碳，通過上述改性方法可以實(shí)現(xiàn)防止肝素由于離子鍵合洗脫流失的同時(shí)，肝素與高分子材料之間的間隔可以確保肝素的柔軟運(yùn)動(dòng)性，進(jìn)而能夠長時(shí)間保持持續(xù)優(yōu)異的抗血栓性;專利US2005266038A1[12]通過胺封端的PEG偶聯(lián)到醛封端的肝素上，隨后除去第二胺上的t-BOC保護(hù)基團(tuán)，然后可以使用第二氨基將肝素間隔部分接枝到聚合物或底物表面上，由此可使肝素分子具有柔性，從而使肝素分子的結(jié)合位點(diǎn)能夠被結(jié)合蛋白接近。采用連接“空間臂”法一方面可以提高肝素分子的自由性，顯著提高共價(jià)鍵合肝素的抗凝血活性;另一方面，相對(duì)離子鍵合，具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可滿足實(shí)際應(yīng)用要求。因此，上述方法成為肝素固定化研究中未來最值得重點(diǎn)研究和完善的技術(shù)。

第二，控制肝素分子與生物材料表面的鍵合量，如終點(diǎn)固定法，專利CN102600515A[13]將高分子材料浸泡在高錳酸鉀的硫酸溶液中，進(jìn)行酸化處理;將材料置于聚乙烯亞胺溶液中，以得到氨基化修飾的表面;將肝素鈉溶于去離子水中，加入亞硝酸，低溫重氮化處理肝素鈉，得到多糖片段A;氧化處理海藻酸鈉，使得海藻酸片段末端暴露醛基，得到多醛基海藻酸鈉，即多糖片段B;配置多糖片段A和B的反應(yīng)液，將氨基化修飾表面的材料置于反應(yīng)液中，通過終點(diǎn)固定法得到復(fù)合涂層。所得涂層中海藻酸鈉和肝素集團(tuán)固定在材料的表面，增大與血液接觸的面積，有效發(fā)揮性質(zhì);終點(diǎn)固定法實(shí)施方便，結(jié)合牢固，空間構(gòu)象好，能有效增加生物相容性和抗凝活性。

就穩(wěn)定性而言，通過共價(jià)鍵合法遠(yuǎn)較離子鍵合法和物理混合法的高，但就固定化肝素的抗凝血性來說，一般卻正相反。因此，如何提高共價(jià)鍵合固定化肝素的抗凝血性，同時(shí)又不影響生物材料的本體性能，一直是肝素化生物材料領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容。為了平衡上述問題，出現(xiàn)了同時(shí)使用離子鍵和共價(jià)鍵結(jié)合的方式，如US4118485[14]，首先用伯胺試劑處理，使得肝素基本上所有陰離子基團(tuán)被烷基銨離子封閉，然后用二醛處理生物材料表面，這種穩(wěn)定化處理肝素具有完全的生理活性，并且在與血液或血漿接觸時(shí)不從表面釋放。

5 結(jié)語

基于固定化肝素的穩(wěn)定性和生物材料的抗凝血性的抗衡，共價(jià)鍵合法和離子鍵合法成為固定化肝素的兩種主要方式。今后的研究重點(diǎn)應(yīng)放在肝素固定化技術(shù)的改進(jìn)上，研制出抗凝血性良好，同時(shí)其他生物學(xué)性能優(yōu)良的新型抗凝血生物材料。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?KANEGAFUCHI CHEM KK.COMPOSITION FOR ARTIFICIAL BASEMENT MEMBRANE AND IMPLANTATION DEVICE WITH ARTIFICIAL BASEMENT MEMBRANE：JPH01124465A[P].1989.

[2] Bo Johnson，等.Compositon and method for coating medical devices：US2003161938A1[P].2003.

[3] 趙薈菁，等.一種小口徑絲素蛋白管狀材料及其制備方法：CN101879330A[P].2010.

[4] GERALD A . GRODE等.Biocompatible Materials for Use in the Vascular System [J].J. BIOMED. MATER. RES. SYMPOSIUM，1972（3）：77–84.

[5] AMANO KENICHI，等.ANTICOAGULANT INTRODUCER SHEATH：JP2000202031A[P].2000.

[6] Eiichi Masuhara，等.METHOD FOR PROVIDING ANTICOAGULANT SURFACES ONTO ARTICLES：US3717502A[P].1973.

[7] Heparin plastic anticoagulant coating - based on heparin-cationic surfactant complexand polymethacrylates， polyepichlorohydrin or polyurethane：JPS498583A[P].1974.

[8] 閆玉華，等.多孔、分層、三維空間多級(jí)結(jié)構(gòu)的組織支架材料及其制備方法：CN1836743A[P].2006.

[9] Sean M Stucke，等.Composition and method for preparing biocompatible surfaces：US2005244453A[P].2005.

[10] HIRABAYASHI，等.FIBROIN MOLDINGS， PROCESS FOR THEIR PREPARATION， HEPARIN-IMMOBILIZING CARRIER，AND PROCESS FOR ITS PREPARATION：EP0352330A1[P].1990.

[11] NIPPON SHERWOOD KK，等.High polymer material having persistent anti-platelet activity - contains heparin molecule polyvinylidene chloride chloropolyethylene， chloropolypropylene and copolymer：JPH09108331A[P].1997.

[12] ThierryGlauser，等.Antifouling heparin coatings：US2005266038A1[P].2005.

[13] 李彤，等.一種多糖分子片段復(fù)合涂層的制備方法：CN102600515A[P].2012.

[14] ERIKSSON JAN CHRISTER，等.Non-thrombogenic medical article and a method for its preparation：US4118485[P].1978.