高效液相色譜法測定食品中羅丹明B含量的不確定度評估

朱曉雯 付金鳳

摘 要：本試驗的目的是建立高效液相色譜法測定羅丹明B的不確定度評估方法，采用食品中羅丹明B經(jīng)固相萃取、反相色譜柱分離、流動相等度洗脫、外標(biāo)法定量的方法，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》考察了稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、儀器重復(fù)測量等帶入的不確定度，并對不確定度的各分量進行計算合成。結(jié)果顯示，當(dāng)食品中羅丹明B的含量為0.0052±1.81×10-4mg/kg時，在95%的置信區(qū)間下，其擴展不確定度為1.81×10-4mg/kg（k=2）。究其原因，測定過程中的不確定度主要來源于對照品稱量、對照品溶液制備及樣品定容過程。因此得出結(jié)論，本方法對食品中羅丹明B的含量測定具有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞：不確定度 ?高效液相色譜法 ?食品 ?羅丹明B

引言

羅丹明B（Rhodamine B）是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，其在溶液中會發(fā)出強烈的熒光，常用于實驗室中細(xì)胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。羅丹明B曾經(jīng)被用作食品添加劑，但經(jīng)實驗證明其存在致癌性后，已被禁止用于食品染色。但是，時至今日，仍有一些不法商販在各種調(diào)味料的生產(chǎn)中使用羅丹明B以達(dá)到以次充好的目的。

本研究采用高效液相色譜法[1]對食品中羅丹明B的含量進行測定，并依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1-2012）[2]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[3]（CNAS-GL06）對食品中羅丹明B檢測的不確定度進行測量和分析，以期為食品中羅丹明B的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純），德國默克公司;羅丹明B對照品（批號510081-201401），中國食品藥品檢定研究院;供試樣品為花椒油（批號：2016.04.08），廠家A。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司;METTLER XP105電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18（4.6×250mm，5μm）;流動相：0.1%甲酸水溶液︰乙腈（45︰55）;檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長550nm、發(fā)射波長580nm;流速：1mL/min;柱溫：5℃;進樣量：10μL;等度洗脫。

1.3.2 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取羅丹明B對照品10mg置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液管精密吸取0.5mL儲備液至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，作為標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用含0.1%甲酸的乙腈水溶液將中間標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備方法

稱取試樣1g（精確到0.01g）置于50mL離心管中，加入10.0mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液混勻后于漩渦混勻器上渦旋15min，再于8000r/min離心10min，取3mL提取液層過0.45μm有機相濾膜待凈化。將上述提取液1mL移至固相萃取小柱中，加樣前先分別用3mL甲醇與水活化，上樣后依次用3mL0.1%甲酸水溶液、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱。然后，用6mL氨水甲醇溶液洗脫目標(biāo)物，收集流出液，在45℃水浴中氮氣吹干，用0.5mL0.1%甲酸的乙腈水溶液溶解殘渣，通過0.22μm濾膜至進樣瓶，作為供試品溶液。

1.3.4 測定方法

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液10μL進樣，依據(jù)上述色譜條件，以保留時間定性，用外標(biāo)法計算試樣中羅丹明B的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中羅丹明B的含量按照公式計算：

。

式中：X為羅丹明B的含量，mg/kg;c為試樣中羅丹明B峰面積對應(yīng)的濃度，ng/mL;V為試樣定容體積，mL;m為稱樣量，g;f為稀釋因子。

2.2 各分量不確定度的來源

①標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度：a.標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度u（Wr），b.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程引入的不確定度u（Vr）;②供試品溶液引入的不確定度：a.樣品稱量引入的不確定度u（Wx），b.樣品稀釋過程引入的不確定度u（Vx）;③高效液相色譜儀引入的不確定度u（y）;④樣品加標(biāo)回收率重復(fù)性實驗引入的不確定度u（FRec）。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.1.1 樣品稱量過程

根據(jù)天平檢定證書，50g內(nèi)所使用天平的最大允差為±0.0005g，置信區(qū)間為95%。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則。樣品稱量5次，分別為1.0213、1.0225、1.0156、1.0278、1.0106g，

對應(yīng)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：6.92×10-4、6.91×10-4、6.96×10-4、6.88×10-4、7.00×10-4。

則樣品稱量引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.1.2 樣品制備稀釋過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

玻璃儀器在20℃校準(zhǔn)，而實驗室溫度在（20±5）℃范圍內(nèi)波動，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按均勻分布計算，，溶液溫度與校正時溫度差引起的水體積不確定度為。

由于樣品制備過程中使用了1、10mL移液管（均為A級），因此按照《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）[4]的要求，均有相應(yīng)的允許偏差。按照矩形分布考慮，，由此估算本實驗中涉及到的玻璃器皿的相對不確定度分量分別為4.09×10-3、1.30×10-3。

樣品制備過程中稀釋因子引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 對照品溶液制備過程引入的不確定度

2.3.2.1 對照品稱量過程

根據(jù)天平檢定證書，十萬分之一天平的最大稱量誤差為±0.1mg。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則

，稱取10mg羅丹明B由天平引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.2 對照品制備過程中稀釋因子

對照品溶液制備過程中使用了10、25、50、100mL容量瓶及1mL移液管，均為A級。對照品制備稀釋過程中引入與涉及到的玻璃器皿的相對不確定度分量分別為1.30×10-3、6.06×10-4、8.37×10-4、5.80×10-3、4.09×10-3，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 高效液相色譜儀引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本研究采用島津高效液相色譜儀LC-20A進行測定，校準(zhǔn)證書上儀器的定量重復(fù)性誤差為1.1%（n=5），則液相色譜儀的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： 。

2.3.4 樣品溶液制備過程中由重復(fù)性引起的不確定度及由樣品取樣量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品重復(fù)測定6次，回收率實驗中的回收率分別為89.05%、87.27%、89.56%、86.41%、90.17%、88.26%，平均回收率為88.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，統(tǒng)計結(jié)果為正態(tài)分布，置信水平95%，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。式中：s為標(biāo)準(zhǔn)偏差;FRec為平均回收率;n為回收率實驗6次。

2.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合上述不確定度分量，則合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

通過實驗測得平均加樣含量為0.0052mg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0052×0.0174=9.05×10-5mg/kg。

2.5 擴展不確定度

在95%置信區(qū)間下，取包含因子k=2，則擴展不確定度為9.05×10-5×2=1.81×10-4mg/kg，以樣品平均含量測得0.0052mg/kg，故本次實驗結(jié)果的不確定度為0.0052±1.81×10-4mg/kg（k=2）。

3 結(jié)論

本研究對食品中添加羅丹明B含量檢測的不確定度來源進行了較為全面的分析，從研究結(jié)果可知，其主要來源為對照品稱量、稀釋過程及供試品稀釋過程引入的不確定度。因此，在實際檢測工作中，天平的定期檢定與維護保養(yǎng)、玻璃量器的校準(zhǔn)，以及實驗室溫濕度[5]的控制對進一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。

參考文獻：

[1] BJS 201905《食品中羅丹明B的測定》[Z].

[2] JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[S].

[3] 中國合格評定國家認(rèn)可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南[M].北京：中國計量出版社，2006.

[4] JJG 196-2006《常用玻璃量器》[S].

[5] 朱曉雯，郭芯岐.高效液相色譜法測定減肥類保健食品中酚酞含量的不確定度評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（15）：3954-3957.