一株耐鹽真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp.）的戶外培養(yǎng)及油脂提取工藝研究

李濤 趙偉 楊冰潔 陳子碩 吳華蓮 吳后波 向文洲

（1. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510301；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣州 510301）

微藻油具有制備生物柴油的潛力，受到國(guó)內(nèi)外政府和科學(xué)家的廣泛關(guān)注［1］，微藻油除了可以作為生物柴油的生產(chǎn)原料外，其特殊的脂肪酸組成也賦予它在抗氧化、損傷修復(fù)及提高免疫力等方面的活性［2］。

真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos）具有生長(zhǎng)速率快、可以積累高含量微藻油和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）等特性，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的微藻資源［3］。魏氏真眼點(diǎn)藻（Eustigmatosvischeri）的生物質(zhì)濃度可以達(dá)到9.14 g/L、總脂含量達(dá)到60.8% DW（Dry weight），波氏真眼點(diǎn)藻（Eustigmatospolyphem）的生物質(zhì)濃度甚至可以達(dá)到11.0 g/L、總脂含量超過(guò)50% DW，目前對(duì)于真眼點(diǎn)藻的研究主要集中在氮、磷對(duì)其生長(zhǎng)和油脂積累的影響（室內(nèi)）［4-5］，戶外培養(yǎng)與室內(nèi)培養(yǎng)存在較大差異，如溫度、光照、微生物等都難以控制，室內(nèi)數(shù)據(jù)可能與戶外數(shù)據(jù)存在較大的偏差［6］。用于微藻培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器有多種類型，包括柱式、管式和平板式等［7］，其中，平板式光生物反應(yīng)器具有比表面積大、光線穿透性率高、加工方便等優(yōu)點(diǎn)［8］，被廣泛用于微藻養(yǎng)殖中，Gao等［9］利用室內(nèi)平板式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)波氏真眼點(diǎn)藻（Eustigmatoscf.polyphem），獲得了0.142 g/L·d的生物質(zhì)產(chǎn)率，可見(jiàn)平板式光生物反應(yīng)器適于真眼點(diǎn)藻的培養(yǎng)，戶外培養(yǎng)條件下是否也可以獲得同樣的生物質(zhì)產(chǎn)率，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

微藻油脂屬于細(xì)胞內(nèi)油脂，需要采用合適的方法將其提取出來(lái)，常用的提取方法包括正己烷/乙醇、氯仿/甲醇等體系［10］，如氯仿/甲醇體系需要在50℃的條件下攪拌數(shù)小時(shí)，才可以獲得較高的提取效率［11］，作為食品用途的油脂，上述溶劑存在潛在的致毒害風(fēng)險(xiǎn)［12］。因此，尋找一種更加安全無(wú)污染的提取溶劑至關(guān)重要。乙醇具有親水性和親脂性雙重特性，細(xì)胞穿透性強(qiáng)，是一種常用的有機(jī)提取溶劑［13］，也有用乙醇進(jìn)行微藻油脂提取的報(bào)道［14］，如果可以利用乙醇提取真眼點(diǎn)藻油脂，將大幅降低真眼點(diǎn)藻油脂的提取成本。

本研究利用自行設(shè)計(jì)的一套平板式光生物反應(yīng)器，評(píng)價(jià)一株耐鹽真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的戶外生產(chǎn)性能，同時(shí)研究乙醇提取真眼點(diǎn)藻油脂的可行性，研究結(jié)果為真眼點(diǎn)藻油的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)方法 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）分離自寧夏固原市羅洼鄉(xiāng)（N36°15'28.23″，E106°35'12.76″），現(xiàn)保藏于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所海藻資源與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

利用氮元素減量的BG-11培養(yǎng)基作為真眼點(diǎn)藻戶外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有以下成分為:NaNO3（0.5 g/L），K2HPO4·3H2O（40 mg/L），NaHCO3（2.0 g/L），MgSO4·7H2O（75 mg/L），CaCl2·2H2O（36 mg/L），F(xiàn)eCl3·6H2O（3.15 mg/L），Citric acid（6.0 mg/L），EDTANa2·2H2O（4.36 mg/L），H3BO3（2.86 mg/L），MnCl2·4H2O（1.18 mg/L），ZnSO4·7H2O（0.22 mg/L），Na2MoO4·2H2O（0.39 mg/L），Co（NO3）2·6H2O（0.05 mg/L）和 CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）。

1.1.2 平板式光生物反應(yīng)器設(shè)計(jì) 平板光生物反應(yīng)器利用普通白玻璃（厚度1.0 cm）與硅膠加工而成，不銹鋼外框加固反應(yīng)器，兩種規(guī)格包括:（1）光徑4 cm:高度120 cm（裝液高度100 cm），長(zhǎng)度120 cm，有效體積為48 L；（2）光徑6 cm:高度120 cm（裝液高度100 cm），長(zhǎng)度120 cm，有效體積為72 L。

采用反應(yīng)器外表面噴淋的方式降溫，藻液溫度保持在28℃（環(huán)境溫度為33-35℃）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 戶外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 選擇廣州非雨季進(jìn)行戶外評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為10 d，藻細(xì)胞經(jīng)室內(nèi)擴(kuò)種后，直接接入戶外4 cm和6 cm平板式光生物反應(yīng)器中，初始接種OD750為0.5，連續(xù)鼓入二氧化碳加富的壓縮空氣提供碳源和攪拌（1% CO2），培養(yǎng)周期內(nèi)，白天平均溫度在33.4 ± 1.2℃，平均光照強(qiáng)度1 000 ±280 μmol photons/m2s，每2 d測(cè)定生物質(zhì)濃度，離心收集藻細(xì)胞，凍干后測(cè)定總脂含量和脂肪酸組成，每天鏡檢觀察雜藻和原生動(dòng)物情況。

1.2.1.2 乙醇提油實(shí)驗(yàn) （1）不同提取時(shí)間對(duì)油脂提取率的影響:常溫條件下，利用100%乙醇進(jìn)行攪拌抽提，0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24 和36 h取樣，利用氮吹儀將乙醇吹干后，利用重量法計(jì)算油脂提取率；（2）不同乙醇濃度對(duì)油脂提取率的影響:設(shè)置乙醇濃度為60%、70%、80%、95%和100%，常溫條件下，提取時(shí)間為8 h，油脂提取率按（1）計(jì)算；（3）不同提取溫度對(duì)油脂提取率的影響:設(shè)置提取溫度為20、30、40、50、60和70℃，提取時(shí)間8 h，乙醇濃度為100%，油脂提取率下述公式計(jì)算。

油脂提取率（%）= m2/（m1× 32.5%）×100%其中，32.5% DW為本研究所用藻粉的總脂含量（采取改良的Khozin-Goldberg法測(cè)定），乙醇提取的油脂重量用m2表示，藻粉重量用m1表示。

油脂品質(zhì)檢測(cè):將乙醇提取得到的油脂進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)，利用硅膠柱層析法測(cè)定不同脂類組分的比例，利用氣相色譜法測(cè)定油脂的脂肪酸組成。

1.2.2 測(cè)定方法

1.2.2.1 形體觀察 利用光學(xué)顯微鏡（Olympus CX41，Olympus Corporation，Japan），觀察藻細(xì)胞形態(tài)特征。

1.2.2.2 分子鑒定及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 利用CTAB法提取DNA，利用18S rRNA的引物對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增（正向引物:5'-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，反向引 物 :5'-CACCTACGCAAACCTTGTTACGACTT-3'），PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)，采用Clustal X 1.8和MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2.3 生物質(zhì)濃度和生物量的測(cè)定 取10 mL的藻液，用預(yù)先80℃烘干至恒重的混合纖維濾膜（0.45 μm）進(jìn)行抽濾，再將有藻細(xì)胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，用減差法得到生物質(zhì)濃度。

生物量（g）= 生物質(zhì)濃度（g/L）× 培養(yǎng)體積（L）

1.2.2.4 總脂含量的測(cè)定和分級(jí) 采取改良的Khozin-Goldberg法測(cè)定藻粉中總脂含量［15］。

以一定體積的氯仿-甲醇（1∶1，V∶V）溶解總脂，利用硅膠層析柱（500 mg Sep-PakTMcartridge of silicagel，Waters）進(jìn)行總脂分級(jí)。上樣后，依次利用氯仿、丙酮和甲醇洗脫獲得中性脂（主要為TAG），粗糖脂（GLs）和磷脂（PLs），每一組用氮?dú)獯蹈芍梁阒?，得到不同脂類組分的重量［15］。

1.2.2.5 脂肪酸相對(duì)含量的測(cè)定 參照李濤等［15］的方法，凍干藻粉（或藻油10 mg）在H2SO4的催化作用下，生成脂肪酸甲酯，隨后利用氣相色譜測(cè)定脂肪酸相對(duì)含量，利用37種標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)脂肪酸種類進(jìn)行鑒定。

1.2.2.6 產(chǎn)率的計(jì)算

單位體積生物質(zhì)產(chǎn)率（g/L·d）=（m2-m1）/Δt

單位面積生物質(zhì)產(chǎn)率（g/m2·d）=（m2-m1）× h/Δt其中:m2為t2時(shí)間的生物質(zhì)濃度（g/L），m1為t1時(shí)間的生物質(zhì)濃度（g/L），Δt為培養(yǎng)時(shí)間（t2-t1），h為反應(yīng)器的藻液高度（m）。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 本論文中所有圖表所示的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均由2個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)測(cè)定重復(fù)計(jì)算獲得；利用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（ANOVA）；采用S-N-K方法對(duì)不同處理組進(jìn)行多重比較；樣品均值之間的差異用最小顯著性差異（LSD）進(jìn)行分析，置信度為0.05。

2 結(jié)果

2.1 藻種形態(tài)及分子進(jìn)化樹(shù)

圖1-A-D為 真 眼 點(diǎn) 藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的形態(tài)特征，該藻為單細(xì)胞球形，直徑為8-12 μm，細(xì)胞內(nèi)存在多個(gè)震動(dòng)顆粒，細(xì)胞內(nèi)液泡，存在紅色或橙色異質(zhì)區(qū)域，葉綠體呈裂葉狀周生，細(xì)胞以產(chǎn)生2個(gè)D型或4個(gè)正四面體的似親孢子進(jìn)行繁殖，上述形態(tài)特征特征與波氏真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos polyphem）特征相符。根據(jù)真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821的細(xì)胞形態(tài)（圖1）和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［16］，推測(cè)真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）屬于真眼點(diǎn)藻（Eustigmatophyceae）、真眼點(diǎn)藻目（Eustigmatales）、真眼點(diǎn)藻科（Eustigmataceae）、真眼 點(diǎn) 藻 屬（Eustigmatos）， 因 此，Eustigmatossp.SCSIO-45821可能為波氏真眼點(diǎn)藻（E.polyphem）。

圖1 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的形態(tài)特征

2.2 戶外生長(zhǎng)情況

真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）在不同光徑平板反應(yīng)器中的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，培養(yǎng)第0-4天，4 cm光徑反應(yīng)器中真眼點(diǎn)藻的生長(zhǎng)速率快于6 cm光徑反應(yīng)器，而4 d后，6 cm光徑反應(yīng)器的生長(zhǎng)速率快于4 cm光徑反應(yīng)器，至培養(yǎng)結(jié)束（第10天），6 cm光徑反應(yīng)器的生物質(zhì)濃度達(dá)到1.1 g/L，較4 cm 光徑反應(yīng)器（1.0 g/L）增加了10.0%。培養(yǎng)體積乘以生物質(zhì)濃度等于生物量，計(jì)算得到6 cm光徑反應(yīng)器的生物量為76.3 g，而4 cm光徑反應(yīng)器僅有46.3 g，6 cm光徑反應(yīng)器比4 cm光徑反應(yīng)器增加了64.8%（P＜0.01），由此可見(jiàn)，6 cm光徑反應(yīng)器更加適合真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）生物質(zhì)的積累，鏡檢觀察確認(rèn)整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中兩種反應(yīng)器均未出現(xiàn)雜藻和原生動(dòng)物污染，保證了結(jié)果的可信性。

培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（第10天），兩種光徑反應(yīng)器中藻液的顏色如圖3所示:6 cm光徑反應(yīng)器藻液顏色為綠色，而4 cm光徑反應(yīng)器中藻液顏色變?yōu)辄S綠色，上述現(xiàn)象說(shuō)明:4 cm光徑反應(yīng)器中藻細(xì)胞色素的組成和含量可能與6 cm光徑反應(yīng)器存在差異。

2.3 脂類積累及脂肪酸變化規(guī)律

圖2 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）在不同光徑平板光生物反應(yīng)器的生長(zhǎng)情況

圖3 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）在不同反應(yīng)器中顏色變化

培養(yǎng)0-6 d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種光徑反應(yīng)器的總脂含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，4 cm光徑反應(yīng)器的油脂積累速率快于6 cm光徑反應(yīng)器，它們均在第6天達(dá)到最大值，4 cm光徑反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821的總脂含量為30.1% DW，較6 cm光徑反應(yīng)器增加32.0%（P＜0.01），6 d后，兩種光徑反應(yīng)器的總脂含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，至培養(yǎng)第10天，6 cm光徑反應(yīng)器降至15.6% DW，4 cm光徑反應(yīng)器降至25.8% DW（圖4）。

圖4 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）總脂含量的變化規(guī)律

真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp.）的主要脂肪酸包括 C14:0、C16:0、C16:1、C18:1、C18:2、C20:4和C20:5（EPA），其中，C16:1的相對(duì)比例高于其他脂肪酸，隨著培養(yǎng)時(shí)間，C16:1呈增加趨勢(shì)，4 cm光徑反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821最高C16:1含量為57.6% TFA（Total fatty acid），6.0 cm光徑反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，最高為56.4% TFA；然而C20:5（EPA）在第4天達(dá)到最高值，4 cm光徑反應(yīng)器為8.2% TFA，6 cm 光徑反應(yīng)器為8.9% TFA，隨后開(kāi)始降低，4 cm光徑反應(yīng)器EPA含量的降低幅度高于6.0 cm光生物反應(yīng)器，培養(yǎng)結(jié)束（第10天），4 cm光徑反應(yīng)器僅有2.2% TFA，而6 cm光徑反應(yīng)器為4.0% TFA，兩者相比存在顯著性差異（P＜0.01）（圖 5）。

2.4 乙醇油脂提取工藝

為了評(píng)估利用乙醇提取真眼點(diǎn)藻油的可行性，本論文開(kāi)展了單因素對(duì)油脂提取率影響的研究，包括提取溫度、乙醇濃度及提取時(shí)間（圖6），結(jié)果表明:提取溫度對(duì)油脂提取率影響較小，提取溫度在20-60℃范圍內(nèi)，提取率保持在49.5%，當(dāng)提取溫度為70℃度時(shí)，提取率反而降低，為40.0%。乙醇濃度對(duì)提取率的影響較大，隨著乙醇濃度的提高，油脂提取率增加，100%乙醇濃度時(shí)，油脂提取率最大，為48.8%。提取時(shí)間明顯影響油脂提取率，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)（0.5-48 h），總脂提取率逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間為36 h時(shí)，提取率達(dá)到94.3%，繼續(xù)增加提取時(shí)間，總脂提取率不再增加。上述結(jié)果表明:乙醇可以用于真眼點(diǎn)藻油脂的提取，理想的提取條件為常溫條件下，乙醇濃度100%，提取時(shí)間36 h。

真眼點(diǎn)藻粗油脂類的組成如圖7所示，結(jié)果表明:油脂主要以中性脂為主（主要為三酰甘油），4 cm光徑反應(yīng)器的中性脂比例為71.4% TL，而6 cm光徑反應(yīng)器為66.4% TL，然而，6 cm光徑反應(yīng)器的糖脂和磷脂比例高于4 cm光徑反應(yīng)器，兩種油脂的顏色均為黑褐色，具有流動(dòng)性。

圖5 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）脂肪酸百分含量的變化

圖6 不同提取條件對(duì)真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）油脂提取率的影響

圖7 真眼點(diǎn)藻油（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的脂類組成

藻油的脂肪酸可以影響其下游應(yīng)用，由表1為兩種光徑生物反應(yīng)器藻油的脂肪酸組成，4 cm和6 cm光徑反應(yīng)器都可以積累EPA，其中，6 cm光徑反應(yīng)器藻油的EPA相對(duì)含量可以達(dá)到4.0% TFA，而4 cm光徑反應(yīng)器僅有2.2% TFA，6 cm光徑反應(yīng)器較4 cm 提高了 81.8%（P＜0.01）。

2.5 產(chǎn)率計(jì)算

通過(guò)計(jì)算真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）的生物質(zhì)、總脂和EPA產(chǎn)率，進(jìn)而評(píng)價(jià)其戶外生產(chǎn)性能。由表1可知，兩種光徑生物反應(yīng)器的生物質(zhì)、總脂和EPA產(chǎn)率最高為4-6 d，隨后均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。計(jì)算整個(gè)周期內(nèi)的平均產(chǎn)率可知，6 cm光徑反應(yīng)器的平均生物質(zhì)產(chǎn)率高于4 cm，增加幅度為13.9%，而對(duì)于總脂產(chǎn)率而言，4 cm光徑反應(yīng)器的平均總脂產(chǎn)率高于6 cm光徑反應(yīng)器，增加幅度為53.8%，而對(duì)于EPA產(chǎn)率而言，6 cm 光徑反應(yīng)器的產(chǎn)率高于4 cm光徑反應(yīng)器，6 cm產(chǎn)率達(dá)到0.6 mg/L·d，而4 cm僅有0.2 mg/L·d，增加幅度達(dá)到200%，可見(jiàn)在生物質(zhì)和EPA產(chǎn)率上6 cm更加具有優(yōu)勢(shì)，而在促進(jìn)油脂積累方面4 cm更加具有優(yōu)勢(shì)。

3 討論

3.1 真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）屬于真眼點(diǎn)藻綱（Eustigmatophyceae）、真眼點(diǎn)藻目（Eustigmatales）、真眼點(diǎn)藻科（Eustigmataceae）、真眼點(diǎn)藻屬（Eustigmatos），與波氏真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos polyphemCCAP 860/8）具有較近的親緣關(guān)系。本研究藻株分離自寧夏高原地區(qū)的土壤表面，這與高保燕等［3］報(bào)道的真眼點(diǎn)藻經(jīng)常分布在土壤表面，特別是高原土壤表面的報(bào)道一致，真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）是否與已報(bào)道的波氏真眼點(diǎn)藻具有相同的生物學(xué)特性，還需要后續(xù)更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 真眼點(diǎn)藻油的脂肪酸組成（%總脂肪酸）

表2 真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的生物質(zhì)、總脂和EPA產(chǎn)率

3.2 不同光徑平板式反應(yīng)器對(duì)真眼點(diǎn)藻生長(zhǎng)、脂類積累及脂肪酸組成的影響

微藻生長(zhǎng)受到各種因素的影響，如藻種特性、光照、溫度、微生物等。任何一種條件的改變，都將導(dǎo)致微藻生物質(zhì)產(chǎn)率的改變，因此準(zhǔn)確的藻種生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)應(yīng)該在一年或幾年的不同季節(jié)進(jìn)行，進(jìn)而獲得準(zhǔn)確的生物質(zhì)產(chǎn)率。但為了快速了解藻種的特性，可以選擇天氣較為適宜時(shí)間段進(jìn)行培養(yǎng)，以便快速評(píng)斷藻種是否具有產(chǎn)業(yè)化潛力，如果該藻株不具有產(chǎn)業(yè)化潛力，則無(wú)需進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間評(píng)價(jià)，本研究為了快速了解真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的戶外生長(zhǎng)性能，評(píng)價(jià)時(shí)間設(shè)定為10 d，由于整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的天氣條件非常穩(wěn)定（光照、溫度、無(wú)污染），因此，培養(yǎng)數(shù)據(jù)接近該藻株戶外培養(yǎng)較理想的產(chǎn)率數(shù)值。

光徑對(duì)微藻生長(zhǎng)和脂類積累的影響最終來(lái)源于光的穿透效率［17］，4 cm光徑反應(yīng)器具有更窄的光徑，隨著藻細(xì)胞密度的增加，其具有較6 cm光徑反應(yīng)器更好的光線穿透率。培養(yǎng)前期（0-4 d），真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）在4 cm光徑反應(yīng)器中的生長(zhǎng)速率雖然快于6 cm光徑反應(yīng)器，但兩種光徑反應(yīng)器最終生物質(zhì)濃度并無(wú)明顯差異。但通過(guò)計(jì)算生物質(zhì)產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，6 cm光徑反應(yīng)器的生物質(zhì)產(chǎn)量為76.3 g，4 cm光徑反應(yīng)器僅為46.3 g，這一結(jié)果證明4 cm光徑反應(yīng)器雖然具有更好的光穿透性，但并不能獲得更高的生物質(zhì)產(chǎn)量，我們推測(cè)這可能與真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）的強(qiáng)光適應(yīng)性有關(guān)，在培養(yǎng)周期內(nèi)，白天正午光強(qiáng)最強(qiáng)可以達(dá)到約1 200 μmol photons/m2s，上述強(qiáng)光在短時(shí)間內(nèi)都可能造成藻細(xì)胞光系統(tǒng)的損傷，從而抑制微藻生長(zhǎng)，布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）UTEX 572和UTEX 2441的光飽和點(diǎn)分別為800 μmol photons/m2s和 400 μmol photons/m2s［18］，雨生紅球藻 712 株系游動(dòng)細(xì)胞的光飽和點(diǎn)為 320 μmol photons/m2s［19］，1 200 μmol photons/m2s超過(guò)了多數(shù)微藻的光飽和點(diǎn)，如果微藻接受的光強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)間處于光飽和點(diǎn)以上，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞光損傷［20］。真眼點(diǎn)藻綱微藻常用的培養(yǎng)光強(qiáng)為 150-350 μmol photons/m2s［4-5］，目前還沒(méi)有真眼點(diǎn)藻強(qiáng)光適應(yīng)性的報(bào)道。因此，建議戶外條件下利用平板光生物反應(yīng)器培養(yǎng)真眼點(diǎn)藻，在培養(yǎng)前期應(yīng)盡量避免日光直射，減少?gòu)?qiáng)光對(duì)藻細(xì)胞的損傷。

本研究表明:4 cm光徑反應(yīng)器較6 cm光徑反應(yīng)器更有利于真眼點(diǎn)藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）脂類的積累，4 cm光徑反應(yīng)器中藻細(xì)胞可以接受更強(qiáng)和更長(zhǎng)時(shí)間的光照，而高光照有利于微藻脂類的積累［21］，Liu 等［22］報(bào)道柵藻（Scenedesmusspp.）在400 μmol photons/m2s取得了比 50 μmol photons/m2s和250 μmol photons/m2s更高的總脂含量，與本研究結(jié)果一致。但兩種光徑反應(yīng)器的最高總脂含量均出現(xiàn)在第6天，我們推測(cè)這可能與強(qiáng)光照射引起的光損傷有關(guān)。積累高含量的EPA是真眼點(diǎn)藻受到關(guān)注的原因之一，本研究表明6 cm光徑反應(yīng)器更有利于EPA的積累。Gao等［9］報(bào)道類波氏真眼點(diǎn)藻（E. cf.polyphem）在高光強(qiáng)條件下不利于EPA的積累，這與本研究結(jié)果一致。高光強(qiáng)不利于EPA積累的原因可能為:EPA通常是一種膜脂組成成分［23］，當(dāng)強(qiáng)光照射時(shí)細(xì)胞傾向于分解膜脂，而大量合成儲(chǔ)藏性中性脂，從而導(dǎo)致EPA含量降低。

3.3 利用乙醇提油取真眼點(diǎn)藻油脂

油脂提取是微藻油開(kāi)發(fā)中的重要環(huán)節(jié)，由于微藻細(xì)胞體積較小，難以用物理壓榨法提取微藻油。常用的微藻油脂提取方法是有機(jī)溶劑抽提法［10］，氯仿、正己烷、甲醇與丙酮常用于微藻油脂的提取［24］，但考慮油脂的安全性，上述溶劑使用殘留會(huì)導(dǎo)致油脂存在安全風(fēng)險(xiǎn)［12］。乙醇是一種常見(jiàn)的溶劑，廣泛應(yīng)用于各種活性產(chǎn)物提取當(dāng)中，潛在風(fēng)險(xiǎn)較小［13］。本研究結(jié)果表明:乙醇可以用于真眼點(diǎn)藻油脂的提取，提取溫度對(duì)油脂提取率無(wú)明顯影響，高濃度乙醇可以獲得較高的油脂提取效率，提取時(shí)間越長(zhǎng)，油脂提取率越高，通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得的較優(yōu)提取工藝為:100%乙醇、常溫下浸提36 h，可以獲得94.3%的油脂提取率，該技術(shù)成本低、安全性高，非常適用于用作食品或保健品原料微藻油脂的提取，乙醇可以提取油脂的原因可能是乙醇導(dǎo)致細(xì)胞膜上出現(xiàn)空隙，使細(xì)胞內(nèi)油脂更容易提取［14］。后續(xù)我們將開(kāi)展正交實(shí)驗(yàn)或者響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化油脂提取條件，并嘗試?yán)脻裨迥噙M(jìn)行研究，為更大規(guī)模油脂提取工藝提供參考依據(jù)。

衡量油脂品質(zhì)的指標(biāo)有多種，包括脂肪酸組成、脂類種類、油脂、酸值等，本研究乙醇提取的油脂中含有超過(guò)70% TL的中性脂和4.0% TFA的EPA，是一種具有潛在價(jià)值的食品與保健品原料，但該粗油脂也存在明顯的缺點(diǎn)，油脂中含有高含量的葉綠素而呈現(xiàn)暗黑色，較差的顏色將嚴(yán)重影響其下游應(yīng)用［25］。真眼點(diǎn)藻油需要進(jìn)行脫色與精煉，提高品質(zhì)，與油脂品質(zhì)相關(guān)的其他因素（如酸價(jià)、流動(dòng)性、重金屬等），我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)行分析。

3.4 真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821（Eustigmatos sp.SCSIO-45821）的戶外生產(chǎn)性能

生物質(zhì)產(chǎn)率是評(píng)價(jià)微藻是否具有產(chǎn)業(yè)化潛力的關(guān)鍵指標(biāo)，4 cm和6 cm光徑反應(yīng)器的生物質(zhì)產(chǎn)率分別為80.5 mg/L·d和93.5 mg /L·d，Gao等［9］報(bào)道類波氏真眼點(diǎn)藻（E. cf.polyphem）在室內(nèi)平板式光生物反應(yīng)器（24 h光照，熒光燈提供光源）中的生物質(zhì)產(chǎn)率可以達(dá)到570 mg/L·d，本研究結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于上述結(jié)果，原因可能為:（1）戶外光照時(shí)間并非24 h，藻細(xì)胞受光時(shí)間少，特別是在夜晚無(wú)光的條件下，藻細(xì)胞可能會(huì)分解白天積累的物質(zhì)，而使生物質(zhì)濃度降低；（2）光照強(qiáng)度不穩(wěn)定，過(guò)量的光照可能抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)；（3）細(xì)菌或真菌的影響。如果獲得更加準(zhǔn)確的戶外評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間、多批次的評(píng)價(jià)工作。不考慮多組平板式反應(yīng)器的空間布局問(wèn)題，根據(jù)單組平板式反應(yīng)器的占地面積為0.3 m2，可以計(jì)算4 cm和6 cm光徑反應(yīng)器中單位面積生物質(zhì)產(chǎn)率僅有24.2 g/m2·d和28.1 g/m2·d，目前未見(jiàn)將真眼點(diǎn)藻進(jìn)行戶外跑道池培養(yǎng)的實(shí)例，但同屬真眼點(diǎn)藻的擬微綠球藻的戶外培養(yǎng)報(bào)道較多，Crowe等［26］報(bào)道在戶外開(kāi)放池的生物質(zhì)產(chǎn)率僅有3.3 g/m2·d，可見(jiàn)光生物反應(yīng)器的培養(yǎng)效率遠(yuǎn)高于跑道池。如果按照每年300 d計(jì)算，4 cm（體積為48 L）和6 cm（體積為72 L）光徑反應(yīng)器每年分別可以生產(chǎn)2.02 kg和1.16 kg藻粉，由此可見(jiàn)，6 cm光徑反應(yīng)器更加適宜真眼點(diǎn)藻的培養(yǎng)。如果促使真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)油脂，建議采用兩步培養(yǎng)法，首先利用光徑較大的平板光生物反應(yīng)器，獲得較高的細(xì)胞密度，隨后將微藻轉(zhuǎn)入窄光徑平板光生物反應(yīng)器中誘導(dǎo)油脂積累。

4 結(jié)論

真眼點(diǎn)藻SCSIO-45821可以利用戶外平板式光生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，在生物質(zhì)和EPA產(chǎn)率上6 cm光徑反應(yīng)器更加具有優(yōu)勢(shì)，而在促進(jìn)油脂積累方面4 cm光徑反應(yīng)器更加具有優(yōu)勢(shì)。利用100%乙醇常溫下提取真眼點(diǎn)藻油脂可以獲得94.3%的提取率，所提油脂含有超過(guò)70% TL的中性脂與4.0% TFA的EPA，但藻油顏色需要進(jìn)一步處理。