牦牛FAF1基因的分子特征及其在不同階段卵巢、輸卵管、子宮中的表達

王靜瑜 王萌 潘陽陽 王靖雷 張瑞 馬睿 胡學(xué)權(quán) 仇曉飛 崔燕 余四九 徐庚全

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070）

牦牛（Bos grunniens）為青藏高原特有的原始牛種之一，一般分布于3 000 m以上的高海拔寒冷低氧地區(qū)［1］。牦?？深B強地抵抗嚴寒和饑餓，可作為高原交通運輸工具，還可用來耕地，具有“高原之舟”和“冰河之車”的美稱［2］。而牦牛繁殖力較低，一般二年一胎或三年兩胎［3］。而將胚胎在體外培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚后再進行移植能有效地提高繁殖效率，增加經(jīng)濟收益［4］。FAF1（Fas-associated factor-1）于1995年由Chu等［5］以酵母雙雜交方法篩選得到，為Fas/CD95死亡信號結(jié)合體的成員之一。有研究表明FAF1基因產(chǎn)物是早期胚胎發(fā)育所必需的，F(xiàn)AF1基因缺失會導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯，F(xiàn)AF1突變則會導(dǎo)致卵裂期胚胎死亡［6］?，F(xiàn)已證實，細胞凋亡是生殖調(diào)節(jié)的機制之一，生殖細胞（精子和卵母細胞）的周期性變化與其凋亡過程密切相關(guān)［7］。在細胞凋亡通路中Fas/FasL信號通路起著重要的作用［8］。FAF1作為死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（Death-inducing signaling complex，DISC）重要組成部分，被稱為Fas通路的重要調(diào)控元件，對于Fas通路活化具有重要的調(diào)控作用［9］。除此之外，F(xiàn)AF1還參與卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù)［10］。FAF1蛋白的生物學(xué)功能與其結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，F(xiàn)AF1蛋白含有3個結(jié)構(gòu)域，即Fas相互作用域（FAS-interacting domain，F(xiàn)ID）、死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Death effector domain interacting domain，DEDID）、多泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域［10］。FAF1可以與Fas相互作用介導(dǎo)細胞凋亡，還能與FADD、caspase-8和蛋白激酶CK2-β相互作用促進細胞凋亡［11］。此外，有研究表明，F(xiàn)AF1可以與胞質(zhì)中的RelA（p65）結(jié)合，抑制IKK或NF-κB的其他因子來調(diào)節(jié)NF-κB的活性［12-13］。

FAF1基因在生殖方面存在至關(guān)重要的作用，但在牦牛方面暫無相關(guān)報道。因此，本研究選擇以牦牛為對象，克隆其FAF1基因全長cDNA序列，進一步預(yù)測該基因完整開放閱讀框編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，運用qRT-PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)等方法對FAF1在牦牛生殖系統(tǒng)中的表達進行定位，闡明表達分布特征，旨為進一步研究FAF1在牦牛生殖方面的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗研究所用的主要儀器設(shè)備有PCR儀（T100TMThermal Cycler，Rio-Rad公司，美國）；恒溫培養(yǎng)箱（松下電器有限公司，日本）；實時熒光定量PCR儀（ABI ViiA7，Life technologies公司，美國）；顯微鏡（DP71，Olympus，日本）。本試驗所用的主要試劑有TransZol（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）；GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega，美國），SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，大連）；Goat anti-rabbit IgG-HPP、Rabbit Anti-FAF1antibody（均購 自 Bioss，北京）；Rabbit PolyclonalFAF1Antibody（Novus，美國），SP試劑盒（Bioss，北京）；DAB試劑盒（ZSGB-bio，ZILZ-9019）；DNA純化回收試劑盒（天根，北京）；pMDTM19-T Vector、E.coliJM109 Competent Cells（TaKaRa， 大 連 ）；RIPA裂解液（全式金，北京）；WB試驗所涉及的試劑均來自碧云天生物技術(shù)有限公司（南京）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 試驗樣品于2018年10月采集于青海省西寧市百德屠宰場。挑選年齡相仿且處于不同階段的健康雌性牦牛各3頭，經(jīng)頸動脈放血致死后，迅速采集卵泡期（卵巢上具有成熟卵泡）、黃體期（卵巢有明顯黃體）和妊娠期（子宮有發(fā)育的胎兒）的卵巢、輸卵管和子宮。經(jīng)0.9%的生理鹽水沖洗后，修剪為約1 cm3的組織塊浸泡于4%的中性多聚甲醛溶液中進行固定，以用于后期的免疫組織化學(xué)試驗。剩余組織用錫箔紙包裹后放入凍存袋內(nèi)，迅速放入液氮罐中，防止組織降解變質(zhì)，運回實驗室后存于-80℃超低溫冰箱中，用于后期的分子試驗。

1.2.2 組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 將處于不同階段雌性牦牛組織從-80℃超低溫冰箱取出，按照TransZol試劑說明書提取組織總RNA。將得到的RNA濃度調(diào)一致后參照GoScriptTMReverse Transcription System說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 特異性引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的牛FAF1基因編碼區(qū)，在NCBI Primer-BLAST中設(shè)計特異性引物，試驗選擇β-actin（肌動蛋白）為內(nèi)參基因，本試驗所涉及引物均由上海生工合成，其中FAF1-F1、FAF1-R1用于FAF1基因的全序列的擴增，F(xiàn)AF1-F2、FAF1-R2用于實時熒光定量PCR，引物序列如表1。

表1 引物序列及長度

1.2.4FAF1基因特性分析

1.2.4.1 牦牛FAF1基因的克隆 以牦牛cDNA為模板，β-actin（肌動蛋白）為引物，進行普通PCR，20 μL 體系 :Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。瓊脂凝膠電泳驗證。以FAF1-F1、FAF1-R1為引物，擴增出牦牛FAF1的全序列，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 2min（FAF1-F1、FAF1-R1） 或 8 s（β-actin）， 共 進 行 40 個 循 環(huán) ；72℃條件下10 min，然后保存于4℃。用1%瓊脂糖凝膠檢測條帶擴增結(jié)果。利用DNA純化試劑盒將PCR產(chǎn)物純化后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收結(jié)果。取1 μL純化后的PCR產(chǎn)物加入1 μL pMDTM19-T Vector、3 μL ddH2O、5 μL Solution I，放入 PCR 儀內(nèi)，于16℃放置30 min。取2 μL重組質(zhì)粒加入100 μL JM109感受態(tài)細胞中，冰中放置30 min，42℃放置45 s，再在冰中放置2 min，加入事先放入37℃恒溫箱的SOC培養(yǎng)基890 μL，37℃條件下225 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)1 h，取100 μL涂布于在含有Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆菌于加有Amp、X-gal、IPTG的液體培養(yǎng)基中，37℃擴增過夜后，將菌液送至上海生工測序。

1.2.4.2 牦牛FAF1基因生物信息學(xué)分析 將得到的FAF1測序序列使用NCBI中的在線軟件ORF finde（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行開放閱讀框分析；利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的在線軟件BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對，分析與其他物種同源性，挑選9種不同物種的FAF1序列，使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用在 線 軟 件 SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測牦牛FAF1編碼蛋白的信號肽；利用ExPASy-Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的部分理化性質(zhì)；利用PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）在線分析牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)亞細胞定位；使用PredictProtein（https:∥www.predictprotein.org/）在線軟件預(yù)測FAF1蛋白質(zhì)結(jié)合位點；使用Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）在線分析牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的疏水性；利用TMHMM Server V 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線預(yù)測牦牛FAF1基因編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域；使用IBCP（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page= npsa_gor4.html）在線預(yù)測牦牛FAF1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在線預(yù)測牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；使用NetOGlyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線分析牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的糖基化位點；利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線分析牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點。

1.2.5 實時熒光定量PCR 以牦牛cDNA為模板，F(xiàn)AF1-F2、FAF1-R2為上下游引物，實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，如下:模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，Passive Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸2 min，共進行40個循環(huán)。每個模板均重復(fù)4次，采用2-ΔΔCt法計算FAF1基因在不同時期各個組織的相對表達量。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）

1.2.6.1 組織蛋白提取 先將-80℃保存的樣品取出，按照RIPA裂解液說明書提取組織蛋白。將提取的蛋白與4×上樣緩沖液按3∶1混勻，沸水浴中變性10 min，立即冰浴5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 Western blot 按照SDS-PAGE分離膠和濃縮膠配制體系分別配制8%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳完成后，采用濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，PBST洗去膜上的殘留轉(zhuǎn)膜液，5%脫脂奶粉搖床上孵育3 h，PBST洗滌2次，每次30 min，一抗（Rabbit PolyclonalFAF1Antibody）1∶1 000稀釋4℃孵育過夜，PBST洗滌6次，每次洗滌5 min，二抗（Goat Anti-Rabbit IgG-HRP）1∶1 000稀釋搖床上孵育50 min，PBST洗滌4次，每次20 min。將BeyoECL PLUS A液與BeyoECL PLUS B液按1∶1配置成工作液，滴加至PVDF膜上并避光作用2 min，使用Amersham Imager 600 System進行化學(xué)發(fā)光檢測。根據(jù)成像結(jié)果，利用灰度值分析FAF1蛋白相對表達量（目的/內(nèi)參）。

1.2.7 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）將固定于4%多聚甲醛溶液的組織自來水沖洗24 h，經(jīng)梯度酒精脫水，使用酒苯透明后浸蠟，最后石蠟包埋。利用切片機將組織切為4 μm的連續(xù)性切片。烘片機上烘片6 h，下行脫蠟水化，抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽緩沖液微波熱修復(fù)法（將載玻片放入0.01 mol/L的檸檬酸鹽中，高火加熱至煮沸，轉(zhuǎn)中火維持10 min），冷卻至室溫后，使用3%H2O2溶液37℃下10 min進行阻斷，室溫正常山羊血清工作液封閉（SPA試劑盒A液）15 min，一抗（Rabbit Anti-FAF1antibody）1∶400稀釋后4℃孵育過夜，陰性對照則使用PBS作為一抗，生物素標記山羊抗兔IgG（SPA試劑盒B液）37℃條件下孵育15 min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液15 min，在DAB顯色液中進行顯色，蘇木精復(fù)染后鹽酸酒精分化，最后在自來水中返藍10 min。脫水透明封片。在抗原修復(fù)、阻斷、一抗、B液、C液之后都要用PBS洗滌3次，每次3 min。待晾干后置于顯微鏡下拍照。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 25.0對FAF1基因相對表達量和蛋白相對表達量進行單因素方差分析，每組3次重復(fù)，計算結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示，當(dāng)P＜0.05時表示二者差異顯著，采用Graphpad prism 8進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 牦牛FAF1基因的克隆

經(jīng)核酸凝膠電泳檢測，以β-actin-F、β-actin-R為引物檢測cDNA模板的結(jié)果如圖1所示，其在143 bp處有清晰單一的條帶，符合β-actin基因預(yù)期大小，驗證反轉(zhuǎn)錄cDNA模板為有效模板，可作為模板用于后期的試驗；以FAF1-F1、FAF1-R1為引物檢測引物特異性的結(jié)果如圖2所示，其在1 953 bp處有清晰明亮條帶，且與牦牛FAF1基因預(yù)期大小一致。并將得到的結(jié)果提交至GenBank，登陸號為MK416195。

圖1 β-actin在不同階段子宮、卵巢、輸卵管中的擴增結(jié)果

圖2 特異性引物FAF1-F1、FAF1-R1擴增結(jié)果

2.2 牦牛FAF1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛FAF1基因開放閱讀框分析 根據(jù)NCBI在線工具ORF finder分析FAF1基因序列，結(jié)果顯示FAF1基因起始密碼子于1 bp處，終止密碼子于1 953 bp，最長為1 953 bp，能夠編碼650個氨基酸。

2.2.2 牦牛FAF1基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析 FAF1蛋白分子式為C3231H5068N892O1027S29，原子總數(shù)10 472，分子量為73.77 kD，理論等電點為4.72。在編碼蛋白質(zhì)的650個氨基酸中，谷氨酸Glu含量最高為10.2%，色氨酸Trp含量最低為1.1%，且該蛋白不含吡咯氨酸Pyl和硒半胱氨酸Sec，其中帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為108，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為66。在280 nm的水中，F(xiàn)AF1的消光系數(shù)為55 390 mol/cm（在假設(shè)所有半胱氨酸殘基對形成胱氨酸的條件下）。FAF1蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別為＞20 h和＞10 h。FAF1蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為52.70，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 牦牛FAF1基因所編碼蛋白同源性分析 將牦牛FAF1基因核苷酸序列與綿羊、野牛、寬吻海豚、狗、加州海獅、阿爾卑斯山旱獺、烏干達紅疣猴、人類及野豬的FAF1核苷酸序列進行同源比對，結(jié) 果 依 次 為98.87%、99.84%、96.29%、95.64%、96.29%、95.23%、94.98%、95.03%和 96.28%。 說明牦牛FAF1基因與野牛親緣關(guān)系最近，與烏干達紅疣猴略遠。再將牦牛FAF1基因的氨基酸序列與綿羊、野牛、寬吻海豚、狗、加州海獅、阿爾卑斯山旱獺、烏干達紅疣猴、人類及野豬的FAF1基因氨基酸序列比對分析，結(jié)果顯示牦牛FAF1基因與綿羊的同源性最近可達100%，與寬吻海豚、狗、阿爾卑斯旱獺、烏干達紅疣猴及人的同源性均為99%，與野牛、加州海獅、野豬的同源性略低為97%。使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建FAF1基因系統(tǒng)進化樹（圖3-A），表明牦牛FAF1基因與綿羊、野牛的進化水平更近，與野豬、人類的進化水平略遠。

2.2.4 牦牛FAF1基因編碼蛋白信號肽、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)域分析 根據(jù)在線軟件SignalP-5.0 Server預(yù)測FAF1編碼蛋白信號肽結(jié)果（圖3-B）顯示，該蛋白無信號肽。根據(jù)軟件Protscale預(yù)測FAF1基因編碼蛋白疏水性結(jié)果（圖3-C）表明，位于452位的亮氨酸Leu疏水性最強，分值為2.456，位于547位的谷氨酸Glu親水性最強，分值為-3.767，該蛋白氨基酸親水性大于疏水性，所以為可溶性蛋白。根據(jù)TMHMM Server V 2.0對跨膜區(qū)域的分析（圖4-A），該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2.5 牦牛FAF1基因所編碼蛋白質(zhì)的亞細胞定位及蛋白結(jié)合位點預(yù)測 根據(jù)在線軟件PSORT II Prediction的分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白質(zhì)超過1/2（52.2%）位于細胞核，有超過1/4（23.1%）位于線粒體，有一部分（13.0%）位于細胞質(zhì)，還有一小部分存在于在高爾基體（4.3%）和細胞骨架中（4.3%）。使用在線軟件PredictProtein預(yù)測FAF1蛋白質(zhì)結(jié)合位點，結(jié)果（圖4-B）顯示，該蛋白存在5個蛋白結(jié)合位點，分別位于第1、176-178、458、567和626位氨基酸。

圖3 牦牛FAF1基因系統(tǒng)進化樹及其編碼蛋白信號肽、疏水性預(yù)測

2.2.6 牦牛FAF1基因編碼蛋白質(zhì)糖基化和磷酸化分析 根據(jù)在線軟件NetOGlyc 4.0 Server預(yù)測FAF1糖基化位點結(jié)果，第22位天冬酰胺Asn、第26位丙氨酸Ala和第108位精氨酸Arg的O-糖基化位點潛力值均高于閾值，所以上述3種氨基酸可能成為該蛋白的O-糖基化位點。使用在線軟件NetPhos 3.1 Server預(yù)測FAF1磷酸化位點（圖4-C），結(jié)果表明:FAF1蛋白有72個絲氨酸Ser、33個蘇氨酸Thr、4個酪氨酸Tyr可能成為該蛋白的磷酸化位點。

2.2.7 牦牛FAF1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用在線軟件IBCP預(yù)測FAF1蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4-D）表明:該蛋白主要由3種折疊方式構(gòu)成，300個α-螺旋占比46.15%，83個延伸鏈占比12.77%，267個無規(guī)卷曲占比41.08%。由此可以推測，α-螺旋、無規(guī)卷曲及延伸鏈3種結(jié)構(gòu)是FAF1蛋白二級結(jié)構(gòu)的主體。應(yīng)用在線軟件Phyre2預(yù)測FAF1蛋白三級結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果（圖5）與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

2.3 牦牛FAF1基因在牦牛不同階段組織中的表達分析

qRT-PCR統(tǒng)計分析結(jié)果（圖6）表明FAF1基因的表達普遍存在于不同階段中的卵巢、輸卵管、子宮。卵泡期卵巢、子宮FAF1基因相對表達量顯著高于妊娠期，黃體期輸卵管FAF1基因相對表達量顯著高于卵泡期和妊娠期。FAF1基因的相對表達量在牦牛不同階段各組織中存在差異化表達。

2.4 FAF1蛋白在牦牛不同階段中的表達分析

Western blot結(jié)果（圖7）顯示，F(xiàn)AF1蛋白普遍存在于牦牛不同階段的卵巢、輸卵管和子宮。經(jīng)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示（圖8），妊娠期輸卵管、子宮的FAF1蛋白相對表達量顯著高于卵泡期和黃體期，黃體期卵巢中的FAF1表達量顯著高于卵泡期和妊娠期，F(xiàn)AF1蛋白在牦牛不同階段卵巢、輸卵管和子宮中的相對表達存在差異性。

2.5 FAF1蛋白在牦牛不同階段組織定位情況

圖4 牦牛FAF1編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)合位點、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 FAF1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖9）顯示，F(xiàn)AF1蛋白在不同階段中各組織均存在陽性表達（棕褐色）。在不同階段的同一組織中表達部位并無明顯的差異，在卵巢中主要表達部位為卵巢生殖上皮、顆粒細胞、卵泡膜細胞（圖9-A、圖9-E）和黃體細胞（圖9-B、圖9-F）；在輸卵管中主要表達部位為黏膜上皮細胞（圖9-C、圖9-G）；在子宮中主要表達部位為子宮內(nèi)膜細胞、子宮腺（圖9-D、圖9-H）。

3 討論

圖6 牦牛FAF1基因在不同階段的卵巢、輸卵管、子宮中的表達

圖7 β-actin和FAF1蛋白在牦牛不同階段中不同組織的檢測結(jié)果

本試驗成功克隆牦牛FAF1基因（GenBank登錄號:MK416195），此前該基因只有在人類［14］、牛和小鼠［15］等動物有相關(guān)報道。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，牦牛FAF1基因所編碼的蛋白分子式為C3231H5068N892O1027S29，原子總數(shù)10 472，分子量為73.77 kD，理論等電點為4.72?？删幋a650個氨基酸，其中谷氨酸Glu含量最高為10.2%，色氨酸Trp含量最低為1.1%。由此推斷FAF1蛋白表達量過高可能會抑制胚胎的發(fā)育甚至是導(dǎo)致胚胎細胞的死亡。同源性對比分析發(fā)現(xiàn)，牦牛FAF1基因與野牛同源性最高，可達99.84%，與烏干達紅疣猴同源性較遠，為94.98%。牦牛FAF1基因所編碼的氨基酸序列與綿羊的同源性達100%，因此，牦牛FAF1可能與綿羊的生物學(xué)功能一致。同時系統(tǒng)進化樹也顯示牦牛FAF1基因與綿羊、野牛進化水平更接近，與烏干達紅疣猴、人類、野豬的進化水平略遠，與進化規(guī)律基本保持一致。該基因在整個進化過程中保持高度的保守性，但又在種屬之間存在差異性。

圖8 FAF1蛋白在牦牛不同階段不同組織中的相對表達量

圖9 FAF1在牦牛不同階段卵巢、子宮、輸卵管的分布

卵巢不僅能夠產(chǎn)生卵細胞，并且還能分泌多種激素，在生殖中占有十分重要的地位。FAF1基因在黃體期卵巢中的相對表達顯著低于卵泡期和妊娠期，F(xiàn)AF1蛋白在卵巢中的相對表達量在卵泡期、黃體期、妊娠期均存在顯著差異，黃體期表達最高，卵泡期次之，妊娠期最低。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示FAF1蛋白主要分布于卵巢生殖上皮、顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體期黃體細胞。FAF1基因和蛋白在多個組織（包括卵巢和子宮）中檢測到［10］，這與本研究結(jié)果相符。卵巢有許許多多的卵泡，但是它們中的絕大多數(shù)都不能發(fā)育成熟，而是在各發(fā)育階段中逐漸退化［16］，閉鎖卵泡超微結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)卵泡細胞中存在核固縮、胞漿出現(xiàn)空泡、形成閉鎖小體等凋亡形態(tài)的改變，這些變化首先發(fā)生在顆粒細胞中，現(xiàn)在人們普遍認為卵泡閉鎖實質(zhì)就是卵巢顆粒細胞凋亡的結(jié)果［17］，生殖上皮是卵細胞形成的必要因素［18］，卵泡膜細胞分泌的激素在卵泡的發(fā)育和閉鎖過程中起著十分重要作用，F(xiàn)AF1為促凋亡因子且在卵泡膜細胞、顆粒細胞、生殖上皮中表達，因此FAF1可能參與卵泡的閉鎖。黃體期時由于黃體形成，孕激素濃度上升，此時FAF1基因相對表達量低于卵泡期，但是FAF1蛋白表達量高于卵泡期，此前Peluffo 等［19］研究稱，在靈長動物黃體溶解過程中，F(xiàn)AS-FASL系統(tǒng)受黃體酮的明顯調(diào)控。因此推測FAF1在牦牛黃體期卵巢的表達高于卵泡期可能與在靈長動物中一致，F(xiàn)AF1可能受孕激素調(diào)節(jié)表達量升高。FAF1蛋白是小鼠卵母細胞和植入前胚胎中NLRP2蛋白的特異性結(jié)合伴侶，在妊娠期FAF1蛋白的下降可能與NLRP2形成復(fù)合物，該復(fù)合物的缺失會導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯［10］。據(jù)此推測，F(xiàn)AF1對卵泡閉鎖有十分重要的意義，F(xiàn)AF1蛋白在黃體期可能受孕激素的調(diào)節(jié)表達量升高，并且在妊娠期時FAF1蛋白可能與NLRP2特異性結(jié)合保證胚胎的發(fā)育。

輸卵管是精子與卵細胞結(jié)合受精的部位。FAF1在輸卵管的卵泡期、黃體期、妊娠期的相對表達均存在顯著差異，其中黃體期相對表達量最高，妊娠期次之，卵泡期最低。在妊娠期FAF1蛋白表達最高，卵泡期最低。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示輸卵管中主要表達部位為黏膜上皮細胞。有研究認為，輸卵管上皮細胞在血漿高雌激素水平作用下增殖，在血漿高孕激素水平下則發(fā)生凋亡樣退化［20-21］，黃體期和妊娠期孕激素濃度上升，F(xiàn)AF1蛋白可能受孕激素調(diào)節(jié)參與輸卵管上皮細胞的凋亡。因此導(dǎo)致妊娠期基因表達量低，而蛋白表達量高的現(xiàn)象。有研究表明輸卵管黏膜上皮細胞能夠分泌活性物質(zhì)，而這種活性物質(zhì)能為早期胚胎發(fā)育提供了一個相對有利的生理環(huán)境［22］，輸卵管黏膜上皮為早期胚胎創(chuàng)造有利條件，新陳代謝加快，F(xiàn)AF1可能與輸卵管黏膜上皮代謝相關(guān)。綜上所述，F(xiàn)AF1對受精及早期胚胎的發(fā)育具有非常重要的作用。

子宮作為胎兒發(fā)育的場所，在胚胎附植和胎兒孕育中具有十分重要的作用。FAF1在子宮的卵泡期、黃體期、妊娠期的相對表達均存在顯著差異，F(xiàn)AF1蛋白在妊娠期表達量顯著高于卵泡期和黃體期，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示FAF1在子宮中主要表達部位為子宮內(nèi)膜細胞和子宮腺。在妊娠期子宮腺可以分泌多種生物活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞的生理狀態(tài)［23］，其中分泌的活性物質(zhì)包括腫瘤壞死因子（TNF）［24］，而 FAF1 屬于腫瘤壞死因子受體（TNF-R）家族的一員［25］，并且在妊娠早期子宮內(nèi)膜動態(tài)變化中，凋亡占有極其重要的地位［26］，由此推測FAF1可能通過與腫瘤壞死因子結(jié)合調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)，為接納胚胎附植做準備。由此推測FAF1可能與胚胎附植及胚胎早期發(fā)育相關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗成功克隆出牦牛FAF1基因（GenBank登錄號:MK416195），牦牛FAF1基因CDS區(qū)為1 953 bp，編碼650位氨基酸，與野牛核苷酸序列同源性可達99.84%，與綿羊氨基酸序列相似度為100%，與野牛、綿羊親緣關(guān)系較近，與野豬、人類親緣關(guān)系較遠。FAF1在牦牛卵巢、輸卵管、子宮均有表達，但不同生理周期表達水平存在顯著差異，揭示FAF1在牦牛不同階段中具有重要生物學(xué)作用，推測FAF1可能與母牦牛的卵泡閉鎖、受精、早期胚胎的發(fā)育有關(guān)，但其相關(guān)機制有待深入研究。