CAT、CYBA及NIK基因與慢性阻塞性肺疾病及相關(guān)肺動(dòng)脈高壓易感性的關(guān)系*

謝欣蕓， 耑 冰， 苑 群， 王 曦， 李 萍， 謝 駿， 楊 朝△

（1西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院院本部呼吸內(nèi)科，寧夏銀川750011；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院呼吸科，江蘇蘇州215153）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種患病率和致死率均較高的呼吸道疾病，其中肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是COPD 常見的并發(fā)癥及主要的致死原因之一。隨著環(huán)境的改變，COPD 患病率逐年增加，已逐漸成為全球性問題。世界衛(wèi)生組織的研究表明，COPD 的死亡率居全球致死性疾病的第5位［1］，PH 致死率也隨之升高。

氧化應(yīng)激機(jī)制在驅(qū)動(dòng)COPD 及相關(guān)PH 中起著關(guān)鍵作用。p22phox又稱細(xì)胞色素b-245 α 多肽（cytochrome B-245 alpha polypeptide，CYBA），是由CYBA基因編碼的普遍存在的蛋白質(zhì)，是產(chǎn)生超氧化物的NADPH 氧化酶（NADPH oxidases，NOXs）的關(guān)鍵成分［2］。p22phox表達(dá)增加可激活 NOXs 的生成，導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，繼而激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信號(hào)通路，引起氧化應(yīng)激損傷。NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NF-κB-inducing kinase，NIK）的積累是NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵事件，可導(dǎo)致NF-κB 增加。王萍等［3］觀察到 NF-κB 蛋白與肺血管重塑程度呈正相關(guān)，因此可導(dǎo)致肺血管相關(guān)疾病。過多的ROS 可由過氧化氫酶（catalase，CAT）分解，以減少氧化應(yīng)激損傷。目前已有研究表明，CYBA基因 rs1049255 和 rs9932581 位點(diǎn)、CAT基 因 rs1001179 和 rs7943316 位 點(diǎn) 及NIK基 因rs7222094 位點(diǎn)的點(diǎn)突變可導(dǎo)致氧化/抗氧化能力改變，從而介導(dǎo)心血管、呼吸等系統(tǒng)疾病的發(fā)生。因此，本研究通過病例-對(duì)照研究，探討CYBA、CAT及NIK基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與COPD 及相關(guān)PH 發(fā)病易感性的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明遺傳易感基因在COPD 及相關(guān)PH 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)

連續(xù)選取2016年11月～2018年5月就診于寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院院本部漢族穩(wěn)定期COPD 患者250 例作為病例組，選取同期我院127 例漢族健康體檢者為對(duì)照組。所納入COPD 患者符合2013 年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［第1 秒用力呼氣 容 積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）＜70%］［4］。根據(jù)超聲心動(dòng)圖測(cè)得的肺動(dòng)脈收縮壓（pulmonary artery systolic pressure，PASP）將COPD組分為 COPD 相關(guān) PH 組（PASP≥50 mmHg）和 COPD 非PH 組（PASP＜50 mmHg）。PH 診斷根據(jù)2015 年國際超聲心動(dòng)圖PH 的診斷標(biāo)準(zhǔn)（三尖瓣返流速度＞3.4 m/s，PASP≥50 mmHg）［5］。排除標(biāo)準(zhǔn):胸腔積液、肺間質(zhì)疾病等引起的限制性通氣障礙及支氣管哮喘；惡性腫瘤；貧血等血液疾??；糖尿病等內(nèi)分泌疾??；冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、先天性心臟病等心血管系統(tǒng)疾??；自身免疫性疾??；嚴(yán)重的肝、腎功能損傷；靜脈藥物濫用、使用抑制食欲藥物（如右芬氟拉明、阿米雷司及其衍生物等）引起的PH。所有受試者均遵循自愿原則，已簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 研究方法

2.1 DNA 提取 抽取受試者禁食后晨起靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管內(nèi)抗凝，嚴(yán)格按照AxyPrep 血基因組DNA 小量試劑盒（Axygen）說明書操作，測(cè)定DNA濃度后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物制備 引物設(shè)計(jì)使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 軟件，并交由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司合成。rs1001179 位點(diǎn)的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGCAGCAATTGGAGAGCCTCG-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCTGAAGGATGCTGATAACCG-3'，延伸引物序列為5'-GCCCTGGGTTCGGCTAT-3'；rs7943316 位點(diǎn)的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGATTGGCTGAGCCTGAAGTCG-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGTCCACCCTCAGCAGGCAAAT-3'，延伸引物序列為5'-gaaagCTGCCTGTTGCCCCGAG-3'；rs1049255 位點(diǎn)的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGTCGTGTGACCTCGCCCCGGA-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCCCCAGGCAGAGGCTCACG-3'，延伸引物序列為5'-GCAGGTGGGTGCACCTGG-3'；rs9932581 位點(diǎn)的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGGTCACTCAGAGCAGGAACC-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCGGTGGCCATGGGGAATAAA-3'，延伸引物序列為5'-TGGCCATGGGGAATAAACCAGCATT-3'；rs7222094位點(diǎn)的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGTGCTCGTCTGTTACCTCTCT-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGAAGTGCACAGATGGTGGATG-3'，延伸引物序列為5'-CTGCTCCAGTCACGATGGGCACAG-3'。

2.3 測(cè)序驗(yàn)證 使用5 管經(jīng)二代測(cè)序（南京金斯瑞生物科技有限公司）驗(yàn)證的CYBA基因rs1049255 和rs9932581 位點(diǎn)、CAT基因 rs1001179 和 rs7943316 位點(diǎn) 及NIK基因 rs7222094 位點(diǎn) SNP 的人類 DNA 作為陽性對(duì)照，5 管鮭魚精DNA 作為陰性對(duì)照，混雜在待測(cè)DNA 樣本中進(jìn)行SNP 分型，最后結(jié)果完全匹配率接近100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件。以Hardy-Weinberg 平衡定律評(píng)估樣本的群體代表性。直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率（%）。基因型頻率、等位基因頻率的對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。用logistic回歸方法計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），評(píng)估各位點(diǎn)基因多態(tài)性是否會(huì)影響COPD及相關(guān)PH的發(fā)病率。

結(jié) 果

1 臨床資料

本研究共納入 COPD 患者 250 例，其中 COPD 非PH 組 147 例，COPD 相關(guān) PH 組 103 例，健康對(duì)照組127 例。年齡、性別和吸煙指數(shù)在COPD 組與健康對(duì)照組、COPD 非 PH 組與 COPD 相關(guān) PH 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

表1 健康對(duì)照者及COPD組、COPD非PH組和COPD相關(guān)PH組患者的臨床資料Table 1.Clinical characteristics of the healthy controls（control group），and the patients in COPD，COPD without PH and COPD with PH groups

2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

CYBA基 因 rs1049255 和 rs9932581、CAT基 因rs1001179和rs7943316及NIK基因rs7222094位點(diǎn)的基因型在各組間分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性，見表2～4。

表2 CYBA基因rs1049255和rs9932581位點(diǎn)的基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 2.Hardy-Weinberg equilibrium of CYBA gene rs1049255 and rs9932581 loci in the studied groups

表3 CAT基因rs1001179和rs7943316位點(diǎn)基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 3.Hardy-Weinberg equilibrium of CATgene rs1001179 and rs7943316 loci in the studied groups

表4 NIK 基因rs7222094 位點(diǎn)基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 4.Hardy-Weinberg equilibrium of NIK gene rs7222094 locus in the studied groups

3 在健康對(duì)照組與COPD 組之間對(duì)比CAT、CYBA和NIK基因所納入SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布情況

在健康對(duì)照組與COPD 組之間，rs1001179 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而 rs1049255、rs9932581、rs7943316 和rs7222094 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表5。

4 在 COPD 非 PH 組與 COPD 相關(guān) PH 組之間對(duì)比CAT、CYBA 和 NIK 基因所納入 SNP 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布情況

在 COPD 非 PH 組 與 COPD 相 關(guān) PH 組 之 間 ，rs1049255 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），rs7222094 位點(diǎn)等位基因頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），而rs7222094 位點(diǎn)基因型，以及 rs1001179、rs9932581 和rs7943316 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表6。

討 論

CAT 主要通過降解過氧化氫生成氧氣和水來抵抗氧化損傷，在人體中所有主要身體器官中都有表達(dá)。當(dāng)短時(shí)間內(nèi)ROS 產(chǎn)生過多時(shí)，主要由CAT 發(fā)揮抗氧化作用，以維持氧化/抗氧化平衡［6］。而CAT基因單個(gè)位點(diǎn)的核苷酸變異可影響其表達(dá)水平，使其活性降低，抗氧化能力減弱，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，可能參與如肺癌、前列腺癌等的發(fā)生。但這種多態(tài)性的效果似乎并非在所有研究中呈現(xiàn)一致的方向性。rs1001179 位點(diǎn)位于CAT基因啟動(dòng)子區(qū)域，Mc-Culloygh 等［7］證實(shí)，該位點(diǎn) SNP 與女性乳腺癌發(fā)生相關(guān)，且CC 基因型可顯著增加女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)。Goulas 等［8］在對(duì)血脂異常患者的研究中觀察到該位點(diǎn)TT 基因型與較高的糖化血紅蛋白和血漿甘油三酯水平相關(guān)，是增加糖化血紅蛋白和血漿甘油三酯的危險(xiǎn)因素。Ershova 等［9］認(rèn)為該位點(diǎn) C 等位基因是氧化應(yīng)激發(fā)展中的危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致發(fā)生氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn)增加。而本研究檢測(cè)到CAT基因rs1001179位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在健康對(duì)照組和COPD 組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示，與C 等位基因相比，攜帶T等位基因的受試者COPD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較低，提示T等位基因可能為保護(hù)性因素。進(jìn)一步對(duì)COPD 的常見并發(fā)癥PH進(jìn)行易感性分析，并未觀察到該位點(diǎn)在COPD 非PH組和COPD 相關(guān)PH 組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。

CYBA基因位于第16號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，長(zhǎng)度為8.5 kb，包括6 個(gè)外顯子［2］，rs1049255 位點(diǎn)位于該基因的3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）。Xu 等［10］在對(duì)急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)以及冠狀動(dòng)脈狹窄程度的研究中闡明rs1049255 位點(diǎn)多態(tài)性可能對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)具有保護(hù)作用，其G 等位基因可能是該病的保護(hù)性因素。Zhou等［11］在對(duì)終末期腎臟病的基因多態(tài)性研究中闡明該位點(diǎn)與NOXs 活性降低和p22phox蛋白含量降低有關(guān)，其中GG 基因型和G 等位基因可能是抵抗終末期腎臟病風(fēng)險(xiǎn)的保護(hù)因素，這可能是由于GG基因型與ROS產(chǎn)生減少和氧化應(yīng)激減弱有關(guān)。本研究觀察到rs1049255 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在中國寧夏地區(qū)漢族COPD 相關(guān)PH 及COPD 非PH 患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05）；風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示，與GG基因型相比，攜帶AA基因型的 COPD 患者 PH 發(fā)病率較高，與 G 等位基因相比，攜帶A 等位基因的COPD 患者發(fā)生PH 風(fēng)險(xiǎn)較高，GG 基因型及G 等位基因可能為PH 的保護(hù)性因素。

表5 健康對(duì)照組與COPD組間CAT、CYBA和NIK基因SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的對(duì)比Table 5.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in control and COPD groups

NF-κB 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，通過 NF-κB 介導(dǎo)的信號(hào)通路，可以激活核調(diào)節(jié)的多種炎癥因子的表達(dá)［12］。該信號(hào)通路的關(guān)鍵事件是NIK 的積累，可間接引起炎性因子增加，介導(dǎo)COPD 或COPD 相關(guān)PH的發(fā)生［13］。本研究檢測(cè)到NIK基因 rs7222094 位點(diǎn)等位基因頻率在COPD 非PH 組與COPD 相關(guān)PH 組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），但該位點(diǎn)尚未被廣泛研究。Thair等［14］觀察到該位點(diǎn)的SNP與感染性休克患者死亡率顯著相關(guān)，基因型為CC 純合子的患者死亡率將顯著增加。本研究的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示，與C 等位基因相比，攜帶T 等位基因的COPD 患者發(fā)生PH 的風(fēng)險(xiǎn)將減低，提示C 等位基因可能是風(fēng)險(xiǎn)等位基因，但本研究尚未檢測(cè)到該位點(diǎn)基因型在組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。此外，rs9932581 和rs7943316 位點(diǎn)在各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），可能與種族、地域差異、檢測(cè)方法、樣本量大小等因素均有關(guān)。

綜上所述，CAT基因rs1001179 位點(diǎn)T 等位基因可能為COPD 的保護(hù)因子，可降低COPD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；CYBA基因 rs1049255 位點(diǎn) GG 基因型和 G 等位基因及NIK基因rs7222094 位點(diǎn)T 等位基因可能為COPD相關(guān)PH 的保護(hù)因子，可降低COPD 相關(guān)PH 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)于某些COPD 及其相關(guān)PH 高?；颊?，可進(jìn)行基因檢測(cè)，早期預(yù)防及干預(yù)，這為COPD 及其相關(guān)PH基因易感性的個(gè)體化預(yù)防提供了新線索。

表6 COPD非PH組與COPD相關(guān)PH組間CAT、CYBA和NIK基因SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的對(duì)比Table 6.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in COPD without PH and COPD with PH groups