荷葉堿通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)自噬減少巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制研究*

丁 暢， 銀 萍， 趙 奇， 蘇 立

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶400014）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是由機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂和慢性炎癥共同作用而導(dǎo)致的心血管疾?。?］。AS 形成早期，血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下間隙，被激活后分化為巨噬細(xì)胞，并通過清道夫受體無(wú)反饋性下調(diào)而吞噬大量氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細(xì)胞；泡沫細(xì)胞的大量形成是誘導(dǎo)并促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的重要因素［2-3］。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，一些從天然產(chǎn)物中提取的活性成分（如黃芪甲苷［4］、槲皮素［5］、姜黃素［6-7］、川陳皮素［8］等）可以通過減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、促進(jìn)膽固醇流出、減輕炎癥達(dá)到抗AS 的作用。荷葉堿（nuciferine，NUF）是一種從荷葉中提取出的阿樸啡型生物堿，分子式為C19H21NO2。NUF 最為人熟知的作用是通過促進(jìn)脂類代謝而降血脂，近年來(lái)也有研究顯示它具有抗氧化、清除自由基、抗衰老、抑菌等藥效［9］。自體吞噬（簡(jiǎn)稱“自噬”，autophagy）是一種以溶酶體為媒介降解胞質(zhì)中受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的代謝過程。Singh 等［10］觀察到自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)脂滴而促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)代謝。但是NUF是否通過影響自噬減少泡沫細(xì)胞的形成，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。研究顯示磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路在自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11-12］。本研究以 Ox-LDL 誘導(dǎo)人單核-巨噬細(xì)胞系THP-1 構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型，探討NUF 調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

THP-1 細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)于PAN；β-巰基乙醇購(gòu)于Gibco；NUF 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)質(zhì)量檢測(cè)所；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和 LY294002 購(gòu)于 APExBIO；Ox-LDL 購(gòu)于廣州奕源生物科技公司；SDS-PAGE 試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；12.5%快速凝膠試劑盒購(gòu)自雅酶生物技術(shù)有限公司；兔抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和P62 抗體購(gòu)自Proteintech；兔抗人p-mTOR 抗體購(gòu)自Cell Signaling Techonology；兔抗人p-Akt 抗體購(gòu)于ZENBIO；總膽固醇微量法測(cè)定試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司；油紅O粉劑購(gòu)自Sigma-Aldrich。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1 細(xì)胞系復(fù)蘇后用完全培養(yǎng)液（12%胎牛血清+RMPI-1640 培養(yǎng)液+1%青、鏈霉素+50 μmol/L β-巰基乙醇）培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。每2 d換一次液，4～5 d傳代。選擇狀態(tài)較好的THP-1 單核細(xì)胞，添加PMA（200 nmol/L）處理24 h，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，隨機(jī)分為:（1）正常對(duì)照（normal control，NC）組:常規(guī)培養(yǎng)液；（2）Ox-LDL 組:常規(guī)培養(yǎng)液中加入50 mg/L Ox-LDL；（3）NUF 組:常規(guī)培養(yǎng)液中加入50 mg/L Ox-LDL 及NUF（5、10 和20 μmol/L）；（4）3-MA 組:先在常規(guī)培養(yǎng)液中加入 10 μmol/L 3-MA 預(yù)處理，2 h 后再加入 50 mg/L Ox-LDL 及 20 μmol/L NUF；（5）LY294002 組:常規(guī)培養(yǎng)液中加入 50 mg/L Ox-LDL 及 10 μmol/L LY294002；（6）LY294002+NUF 組:常規(guī)培養(yǎng)液中加入 50 mg/L Ox-LDL、10 μmol/L LY294002 及 20 μmol/L NUF。加藥后培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 油紅O 染色 油紅O 粉劑用異丙醇溶解為儲(chǔ)存液于4℃避光保存。將THP-1 細(xì)胞按每孔約1×104接種于96 孔板中，種板同時(shí)加入PMA 誘導(dǎo)24 h，使之成為巨噬細(xì)胞，再隨機(jī)分為NC 組、Ox-LDL 組、NUF（5、10 和 20 μmol/L）組和3-MA 組，每組 3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。輕輕吸去培養(yǎng)液，用PBS 洗2 次后，4%多聚甲醛固定20 min，用 PBS 清洗3 遍，油紅O 工作液（儲(chǔ)存液∶雙蒸水=3∶2）染色30 min，用PBS 清洗3 遍后于顯微鏡下觀察。再用90%異丙醇將細(xì)胞內(nèi)油紅O萃取，于525 nm處檢測(cè)吸收光進(jìn)行半定量。

2.3 總膽固醇測(cè)定 按照北京索萊寶微量法總膽固醇試劑盒說明書，用異丙醇將NC 組、Ox-LDL 組、NUF（5、10和20 μmol/L）組和3-MA 組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇萃取出來(lái)，超聲裂解高速離心后取上清加入用檢測(cè)工作液，在500 nm處檢測(cè)吸光度（A）。

2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。以每孔30 μg總蛋白上樣，使用SDS-PAGE 對(duì)變性的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，并在250 mA 的電流下轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h，1∶1 000 稀釋的 I 抗4℃孵育過夜，洗膜，1∶10 000 稀釋的 II 抗室溫孵育 1 h，洗膜，ECL 顯影，凝膠成像儀系統(tǒng)呈像，以β-actin 為內(nèi)參照，ImageJ軟件分析條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 免疫熒光 將細(xì)胞接種于爬片上，加入含有200 nmol/L PMA 的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后，加入mRFP-GFP-LC3 腺病毒感染細(xì)胞，4 h 后換為常規(guī)培養(yǎng)液再培養(yǎng) 1 h，隨機(jī)分為 NC 組、Ox-LDL 組、NUF（20 μmol/L）組和3-MA組。相應(yīng)藥物處理24 h后，用PBS 清洗2 次，每次3 min，多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 清洗后，放于載玻片上，抗熒光淬滅劑封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.6 透射電鏡觀察 將細(xì)胞接種于6 孔板上，用含有200 nmol/L PMA 的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后，隨機(jī)分為 NC 組、ox-LDL 組、NUF（20 μmol/L）組和 3-MA組。相應(yīng)藥物處理24 h 后，常規(guī)胰酶消化法收集細(xì)胞，用PBS 緩沖液洗滌3 次，置于1.5 mL 尖底離心管中離心，棄去上清液，加入2.5%戊二醛固定，輕輕震蕩，使細(xì)胞團(tuán)懸浮于固定液中，4℃冰箱中固定24 h以上，脫水，包埋，超薄切片，染色后于透射電鏡下觀察，并采集照片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraghPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NUF對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及總膽固醇含量的影響

油紅O 染色結(jié)果顯示，NC 組細(xì)胞內(nèi)紅色脂質(zhì)顆粒少或無(wú)；Ox-LDL 組紅色顆粒沉積則較NC 組顯著增加（P＜0.05）；NUF（5、10 和20 μmol/L）組細(xì)胞內(nèi)紅色顆粒沉積均有所減少，其中NUF 濃度為10和20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著減少（P＜0.05），見圖1A。Ox-LDL 組總膽固醇含量較NC 組顯著升高（P＜0.01）；與 Ox-LDL 組相比，不同濃度（5、10 和 20 μmol/L）NUF組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量均有所降低，其中 NUF 濃度為 10 和 20 μmol/L 時(shí)，總膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），見圖1B。

2 NUF對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與 NC 組相比，Ox-LDL組細(xì)胞LC3-II/LC3-I 比值略有降低，而P62 的表達(dá)有所增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Ox-LDL 組相比，NUF 各濃度組 LC3-II/LC3-I 比值均升高，而 P62 的表達(dá)均降低，其中NUF 濃度為20 μmol/L 時(shí)最為顯著（P＜0.01），見圖2。

3 不同干預(yù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)、自噬流及自噬小體的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與 Ox-LDL 組相比，NUF（20 μmol/L）組 LC3-II/LC3-I比值顯著升高（P＜0.01），P62 相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0.05）；與NUF組相比，3-MA 組 LC3-II/LC3-I 比值顯著降低，P62 相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），見圖3A。自噬雙標(biāo)免疫熒光結(jié)果顯示，與NC 組及Ox-LDL 組相比，NUF組自噬流顯著增加（P＜0.01），見圖3B。透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，可見NUF組自噬小體較NC組及Ox-LDL組增多，見圖3C。

Figure 1.Effects of nuciferine（NUF）on intracellular lipid deposition and total cholesterol（TC）content.A:observation of intracellular lipid deposition by oil red O staining（scale bar=50 μm）；B:determination of TC in the cells.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs normal control （NC） group；*P＜0.05 vs Ox-LDL group.圖1 荷葉堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和總膽固醇含量的影響

4 抑制自噬后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及總膽固醇的變化

3-MA 預(yù)處理抑制自噬后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積較NUF組顯著增多（P＜0.01），與NC組相比也有顯著增加（P＜0.01），與Ox-LDL 組類似，見圖4A。細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量測(cè)定也顯示，與NC 組及NUF 組相比，3-MA 預(yù)處理使細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量顯著增多（P＜0.05），見圖4B。

Figure 2.Effect of nuciferine（NUF）on the expression of autophagy-related proteins.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ox-LDL group.圖2 荷葉堿對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

5 NUF 對(duì)PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與 Ox-LDL 組相比，NUF組及 LY294002 組 p-Akt、p-mTOR 和 P62 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），LC3-II/LC3-I 比值均顯著升高（P＜0.01），而 NUF+LY294002 組 p-Akt、pmTOR 和 P62 蛋白水平進(jìn)一步降低（P＜0.05 或P＜0.01），LC3-II/LC3-I 比值進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖5。

討 論

自噬是一種存在于哺乳動(dòng)物中的高度進(jìn)化的自我調(diào)節(jié)過程，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、適應(yīng)各種環(huán)境變化的重要機(jī)制［13］。自噬和脂質(zhì)代謝也有著重要的聯(lián)系，自噬小體可以吞噬脂滴，并在溶酶體酸性脂肪酶的幫助下將它們轉(zhuǎn)移到溶酶體管腔進(jìn)行降解［14-15］。自噬功能障礙會(huì)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生以及脂質(zhì)代謝的紊亂，從而加速AS 進(jìn)程，因此通過藥物調(diào)控自噬可能是減緩AS 的新策略。本研究旨在觀察NUF 是否通過調(diào)控自噬減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，從而減少泡沫細(xì)胞形成及其可能的作用機(jī)制。Ox-LDL 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬功能障礙，從而影響脂質(zhì)代謝，使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，本研究顯示NUF 可以通過促進(jìn)自噬減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，從而減少泡沫細(xì)胞的形成。

Ox-LDL 是誘導(dǎo)血管內(nèi)壁炎癥反應(yīng)的主要危險(xiǎn)因素之一，可以誘導(dǎo)血液內(nèi)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，并激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)，引發(fā)脂質(zhì)積累，然后形成泡沫細(xì)胞；當(dāng)大量泡沫細(xì)胞聚集會(huì)形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊［16-17］。近年來(lái)，許多研究者利用THP-1 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬Ox-LDL 而構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型［18-19］。我們的實(shí)驗(yàn)在加入 50 mg/L 的 Ox-LDL培養(yǎng)24 h 后，模型組內(nèi)油紅O 染色可見細(xì)胞內(nèi)有大量紅色顆粒，表明細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，另外電鏡下也能看見大量脂滴存在，均符合泡沫細(xì)胞形態(tài)，提示泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

微管相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I 是目前廣泛用來(lái)檢測(cè)自噬體的分子標(biāo)志物，與自噬呈正相關(guān)；自噬底物蛋白 P62 也被稱為 sequestosome 1（SQSTM1），作為連接自噬小體和泛素化底物的橋梁，可以使泛素化的底物在自噬溶酶體中降解，與自噬呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示，經(jīng)NUF 處理后，LC3-II/LC3-I比值升高，而P62 表達(dá)減少，且免疫熒光檢測(cè)自噬流增加，透射電鏡下自噬小體增加，表明NUF 能有效促進(jìn)自噬。此前有文獻(xiàn)報(bào)道NUF可以促進(jìn)膽固醇流出而減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積［20］，但未見報(bào)道NUF 減少脂質(zhì)沉積作用與自噬的關(guān)系。本研究觀察了NUF抑制細(xì)胞泡沫化與細(xì)胞自噬的關(guān)系，在予以自噬抑制劑3-MA 后，NUF 誘導(dǎo)的自噬被抑制，同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及總膽固醇含量增多，說明NUF 能通過促進(jìn)自噬而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。

PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在自噬過程中有著重要的調(diào)控作用，是經(jīng)典的自噬途徑［21-22］，并已明確通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路可以促進(jìn)自噬的發(fā)生。本研究中NUF 能下調(diào)p-mTOR 和p-Akt 蛋白水平，于是我們推測(cè)NUF促進(jìn)自噬是否也與該通路有關(guān)。既往研究顯示LY294002 能特異性抑制PI3K/Akt 通路［23］，為此我們將LY294002與NUF 共同孵育以進(jìn)一步證實(shí)猜想，結(jié)果觀察到LY294002與NUF共同處理后，p-mTOR 和p-Akt 蛋白水平降低更為顯著，說明NUF 可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路增強(qiáng)自噬活性。mTOR是調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)與自噬的重要信號(hào)分子［24］。雷帕霉素是mTOR 抑制劑，也是常見的自噬激動(dòng)劑，相關(guān)文獻(xiàn)表明雷帕霉素也有減少泡沫細(xì)胞的作用［25］，但NUF 效果是否與雷帕霉素相同尚未可知，我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。

Figure 3.Effects of different interventions on intracellular autophagy-related protein expression，autophagy flow and autophagosomes.A:the expression levels of LC3-II/LC3-I and P62 were assessed by Western blot analysis；B:immunofluorescence observation of autophagy（scale bar=10 μm）；C:observation of intracellular autophagosomes under transmission electron microscope（scale bar=1 μm）.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs normal control（NC）group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ox-LDL group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs NUF group.圖3 不同干預(yù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)、自噬流及自噬小體的影響

Figure 4.The changes of intracellular lipids and total cholesterol（TC）after inhibition of autophagy.A:observation of intracellular lipid deposition by oil red O staining（scale bar=50 μm）；B:determination of TC in the cells.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs normal control（NC）group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ox-LDL group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs NUF group.圖4 抑制自噬后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及總膽固醇的變化

Figure.5.Effect of nuciferine（NUF）on the expression of PI3K/Akt/mTOR pathway-related proteins.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ox-LDL group.圖5 荷葉堿對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本研究表明NUF 可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路來(lái)增強(qiáng)自噬活性，從而減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及總膽固醇含量，抑制泡沫細(xì)胞的形成。這些結(jié)果為NUF 防治AS、減少泡沫細(xì)胞形成的臨床應(yīng)用提供了參考。