Rip2誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的交互作用及機(jī)制研究*

周 晗， 楊文欣， 王華東， 胡巢鳳△

（1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632；2佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院，廣東佛山528031）

自噬是一種存在于真核細(xì)胞中的保守、常見的代謝過程。在營養(yǎng)缺乏、損傷、高溫、低氧和氧化應(yīng)激等外界刺激以及病原體感染等情況下可誘導(dǎo)自噬［1］。細(xì)胞中單層或雙層膜包繞待降解物，從而形成分隔膜，當(dāng)分隔膜延伸并完全包繞待降解物（如細(xì)胞器和蛋白質(zhì)）則形成自噬體［2-5］。越來越多的研究表明，自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，并且與凋亡存在密切的聯(lián)系；但是，自噬在腫瘤中所起的作用及其與凋亡的確切關(guān)系仍存在較多的爭(zhēng)議。

受體相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，Rip2）屬于Rip 家族成員，廣泛表達(dá)于人體組織（如心臟、腦組織、胎盤、肺、脾臟、胰腺、淋巴結(jié)等），定位于胞漿［6］。NOD 樣受體家族是胞質(zhì)蛋白，其主要成員NOD1 可識(shí)別革蘭陰性桿菌肽聚糖，通過與Rip2 結(jié)合誘導(dǎo)自噬和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，Rip2 對(duì)于NOD1 誘導(dǎo)白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）的產(chǎn)生和自噬體的形成是必不可少的，但未對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在腸上皮細(xì)胞中，NOD2可通過Rip2 的酪氨酸激酶活性激活p38 MAPK 信號(hào)通路，同時(shí)抑制蛋白磷酸酶發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8］。然而，一項(xiàng)關(guān)于克羅恩病的研究表明，NOD1 和NOD2 在細(xì)菌入侵細(xì)胞的位點(diǎn)募集自噬相關(guān)蛋白ATG16L1至細(xì)胞膜，誘發(fā)自噬，抑制炎癥因子的釋放，該過程卻沒有NF-κB和Rip2的參與［9］。

本課題組前期研究證實(shí)，Rip2可通過激活內(nèi)、外源性凋亡途徑誘導(dǎo)人胰腺癌Panc-1 細(xì)胞凋亡［10］；Rip2 還能引起Panc-1 細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能與抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的活化有關(guān)［11］。Rip2誘導(dǎo)的自噬和凋亡是否具有交互作用，有待進(jìn)一步研究。因此，本研究主要探討Rip2 導(dǎo)致的Panc-1 細(xì)胞自噬和凋亡是否具有交互作用及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

Panc-1 細(xì)胞由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院贈(zèng)予。pEGFP-Rip2 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑購自 Polyplus；抗 Rip2 抗體購自 Santa Cruz；抗LC3、beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、Fas、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）和GAPDH抗體均購自Cell Signaling Technology；caspase-3、-8、-9活性檢測(cè)試劑盒購自BioVision；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 購自Med-Chem Express。

2 方法

2.1 自噬抑制劑3-MA 對(duì)Rip2 誘導(dǎo)Panc-1 細(xì)胞凋亡的影響

2.1.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用jetPRIME 分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空質(zhì)粒和pEGFP-Rip2 重組質(zhì)粒至Panc-1 細(xì)胞，6 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)42 h。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 （1）對(duì)照組:僅培養(yǎng)細(xì)胞，不做任何處理；（2）pEGFP-C2 組:轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 質(zhì)粒入細(xì)胞；（3）3-MA組:細(xì)胞培養(yǎng)6 h，加入含自噬抑制劑3-MA的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞42 h；（4）pEGFP-Rip2組:轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2 重組質(zhì)粒至細(xì)胞；（5）pEGFPRip2+3-MA 組:轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2 重組質(zhì)粒至細(xì)胞6h，更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基，同時(shí)加入3-MA，繼續(xù)培養(yǎng)42 h。實(shí)驗(yàn)中所用的3-MA 劑量要求對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，且能抑制Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

2.1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞以每孔0.5×104的密度接種于96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)6 h，再分別加入不同濃度（0.25、0.5、1、2、4 和8 mmol/L）自噬抑制劑3-MA處理42 h，每組6個(gè)復(fù)孔。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 180μL 不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基和 MTT 溶液20 μL，震蕩混勻后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。去上清后，每孔加入DMSO 150 μL，37℃低速震蕩5 min，多功能酶標(biāo)儀于490 nm 檢測(cè)各孔吸光度（absorbance，A），計(jì)算細(xì)胞活力。

2.1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞以每孔3×105的密度接種于6 孔板內(nèi)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞，加 1× binding buffer 及 Annexin VPE，混勻后避光孵育15 min，然后再加入7-氨基放線菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD），混勻后立即上機(jī)檢測(cè)。

2.1.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 用胰酶消化并收集細(xì)胞。加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑，提取細(xì)胞胞漿蛋白并檢測(cè)蛋白的濃度。分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，放置于封閉液中封閉1 h。加入Ⅰ抗，4℃孵育12～16 h，再加入Ⅱ抗，用GAPDH作為內(nèi)參照［10］。

2.1.6 caspase-8、-9、-3活性的檢測(cè) 首先收集細(xì)胞置于離心管內(nèi)，每管細(xì)胞數(shù)量最好為（2～5）×106。用相應(yīng)的試劑盒，按照所需的劑量將2×Reaction Buffer和 DTT 以 100∶1 的體積比混合均勻；每管加入 50 μL冰上預(yù)冷的Cell Lysis Buffer 重懸細(xì)胞沉淀，冰上孵育10 min；10 000×g離心1 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，每管吸取5 μL 細(xì)胞裂解液進(jìn)行BCA蛋白定量；取 100～200 μg 蛋白和 50 μL Cell Lysis Buffer，混合后加入96孔板內(nèi)；再加入50 μL 2× Reaction Buffer（含DTT），并分別加入 5 μL IETD-pNA、LEHD-pNA 和 DEVD-pNA（分別為 caspase-8、-9、-3的底物）。震蕩混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育2 h；用多功能酶標(biāo)儀在405 nm 處測(cè)定各孔A值。將各組A值的平均值與對(duì)照組A值的平均值相比，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算各組細(xì)胞樣品caspase-8、-9、-3的活性。

2.2 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)Rip2誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞自噬的影響

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 （1）對(duì)照組:僅培養(yǎng)細(xì)胞，不做任何處理；（2）pEGFP-C2 組:轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 質(zhì)粒入細(xì)胞；（3）Z-VAD-FMK 組:細(xì)胞培養(yǎng) 6 h，加入含 caspases 抑制劑 Z-VAD-FMK 的 DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 42 h；（4）pEGFP-Rip2 組:轉(zhuǎn)染 pEGFP-Rip2 重組質(zhì)粒至細(xì)胞；（5）pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組:將pEGFP-Rip2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，6 h 后更換培養(yǎng)基，再加入Z-VAD-FMK 繼續(xù)培養(yǎng)42 h。實(shí)驗(yàn)中所用的ZVAD-FMK 劑量要求對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，且能抑制Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.2.2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 參見2.1.5。

2.2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量及形態(tài) 將細(xì)胞以每孔3×105的密度接種于6 孔板，具體方法見參考文獻(xiàn)［11］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用Bonferroni法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 3-MA促進(jìn)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

1.1 轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2質(zhì)粒后細(xì)胞Rip2蛋白表達(dá)的變化 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2 組細(xì)胞Rip2 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），見圖1。以上結(jié)果說明pEGFP-Rip2 質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

Figure 1.The protein level of Rip2 in Panc-1 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group.圖1 Panc-1細(xì)胞Rip2蛋白水平

1.2 MTT 法檢測(cè)不同劑量3-MA 對(duì)Panc-1細(xì)胞活力的影響 用不同濃度（0.25、0.5、1、2、4 和8 mmol/L）的自噬抑制劑3-MA 處理Panc-1細(xì)胞，MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.25、0.5、1 和 2 mmol/L 3-MA對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，而4和8 mmol/L 3-MA可顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L 3-MA 可抑制過表達(dá)Rip2 導(dǎo)致的細(xì)胞自噬，因此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用3-MA 劑量為2 mmol/L，該劑量既不影響細(xì)胞活力，又可以抑制Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

1.3 3 -MA 促進(jìn)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析的散點(diǎn)圖中，Q2 區(qū)表示早期凋亡細(xì)胞，Q4區(qū)表示晚期凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和pEGFP-C2 組相比，pEGFP-Rip2 組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；而與 pEGFP-Rip2 組比較，pEGFP-Rip2+3-MA 組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高（P＜0.05），見圖3。

1.4 3 -MA 對(duì)過表達(dá)Rip2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 pEGFP-Rip2 組細(xì)胞 Fas、Bax 及胞漿 Cyt-c 蛋白水平顯著高于對(duì)照組和pEGFP-C2組（P＜0.05），而pEGFP-Rip2+3-MA 組細(xì)胞 Fas、Bax 蛋白及胞漿 Cyt-c蛋白水平進(jìn)一步升高（P＜0.05）；此外，pEGFP-Rip2組細(xì)胞Bcl-2 蛋白水平顯著低于對(duì)照組和pEGFP-C2組（P＜0.05），而 pEGFP-Rip2+3-MA 組細(xì)胞 Bcl-2 蛋白水平進(jìn)一步下降（P＜0.05），見圖4。

Figure 2.The effect of different doses of 3-MA on the viability of Panc-1 cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 不同劑量3-MA對(duì)Panc-1細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The effect of 3-MA on the apoptosis of Panc-1 cells induced by Rip2.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.圖3 3-MA對(duì)Rip2誘導(dǎo)的Panc-1細(xì)胞凋亡的影響

1.5 3 -MA 增強(qiáng)過表達(dá) Rip2 細(xì)胞 caspase-8、-9、-3 的活性 pEGFP-Rip2 組細(xì)胞 caspase-8、-9、-3 的活性顯著高于對(duì)照組和pEGFP-C2 組（P＜0.05）；與pEGFPRip2 組比較，pEGFP-Rip2+3-MA 組細(xì)胞 caspase-8、-9、-3的活性進(jìn)一步升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 4.The effect of 3-MA on the protein levels of Fas，Bax，Bcl-2 and cytoplasmic Cyt-c in the Panc-1 cells with Rip2 overexpression.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.圖4 3-MA對(duì)過表達(dá)Rip2的Panc-1細(xì)胞Fas、Bax、Bcl-2及胞漿Cyt-c蛋白水平的影響

Figure 5.The effect of 3-MA on caspase-8，-9 and -3 activity in the Panc-1 cells with Rip2 overexpression.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group and pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.圖5 3-MA對(duì)過表達(dá)Rip2的Panc-1細(xì)胞caspase-8、-9、-3活性的影響

2 Z-VAD-FMK促進(jìn)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬

2.1 MTT 法檢測(cè)不同劑量 Z-VAD-FMK 對(duì) Panc-1 細(xì)胞活力的影響 用不同濃度（5、10、20 和40 μmol/L）的 caspases 抑制劑 Z-VAD-FMK 處理 Panc-1 細(xì)胞，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5、10 和 20 μmol/L Z-VAD-FMK 對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著的影響，而40 μmol/L Z-VAD-FMK 可顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.05），見圖6。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L Z-VAD-FMK 可抑制過表達(dá)Rip2 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，因此選擇10 μmol/L 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Z-VADFMK的劑量。

2.2 Z-VAD-FMK 對(duì)過表達(dá)Rip2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，pEGFP-Rip2組細(xì)胞beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著多于對(duì)照組和pEGFP-C2組（P＜0.01）；與pEGFP-Rip2組比較，pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組細(xì)胞 beclin-1 和 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖7。

Figure 6.The effect of different doses of Z-VAD-FMK on the viability of Panc-1 cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖6 不同劑量Z-VAD-FMK對(duì)Panc-1細(xì)胞活力的影響

2.3 Z-VAD-FMK 對(duì)過表達(dá)Rip2 細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的影響 pEGFP-Rip2 組細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量顯著多于對(duì)照組和pEGFP-C2 組；pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量則顯著多于pEGFP-Rip2組，見圖8。

Figure 7.The effect of Z-VAD-FMK on the protein expression levels of beclin-1 and LC3-Ⅱin the Panc-1 cells of different groups.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；##P＜0.01 vs pEGFP-Rip2 group.圖7 Z-VAD-FMK對(duì)各組Panc-1細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 8.Changes of the autophagosomes in Panc-1 cells observed under transmission electron microscope（scale bar=2 μm）.A:control group；B:pEGFP-C2 group；C:Z-VAD-FMK group；D:pEGFP-Rip2 group；E:pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK group.M:mitochondrion；N:nucleus.Arrows indicate autophagosomes.圖8 透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬體的變化

2.4 Z-VAD-FMK抑制過表達(dá)Rip2細(xì)胞Akt 和mTOR 蛋白磷酸化 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組細(xì)胞p-Akt和p-mTOR 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），而總 Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)變化不顯著；與pEGFP-Rip2 組比較 ，pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組 細(xì) 胞 p-Akt 和 pmTOR 蛋白水平進(jìn)一步下降（P＜0.01，P＜0.05），總Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)則無顯著變化，見圖9。上述結(jié)果說明Z-VAD-FMK 可抑制過表達(dá)Rip2 細(xì)胞Akt和mTOR蛋白磷酸化。

討 論

目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞自噬的保護(hù)性和抑制性作用與多種因素相關(guān)，并且具有組織特異性。保護(hù)性自噬可幫助腫瘤細(xì)胞逃避各種刺激因素所誘導(dǎo)的凋亡，而抑制性自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，我們應(yīng)用3-MA抑制細(xì)胞自噬，觀察過表達(dá)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的變化情況；應(yīng)用caspases 抑制劑Z-VADFMK 抑制細(xì)胞凋亡，觀察過表達(dá)Rip2 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的變化情況，從而探究自噬與凋亡的相互作用及其機(jī)制。

外源性途徑和內(nèi)源性途徑是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的2 條主要通路。在外源性凋亡途徑中，胞外的死亡配體結(jié)合于細(xì)胞表面的死亡受體，并使其活化，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。例如，三聚體FasL與其受體Fas結(jié)合后，使Fas的死亡結(jié)構(gòu)域活化，募集接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD），F(xiàn)ADD 可引起 procaspase-8 自我剪切活化，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡。內(nèi)源性凋亡通路是由線粒體損傷導(dǎo)致Cyt-c 釋放及caspases 活化的信號(hào)通路。當(dāng)線粒體受損時(shí)，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，水分進(jìn)入，大量Cyt-c 釋放進(jìn)入胞漿，Cyt-c 作用于凋亡酶激活因子，使caspase-9 活化，從而激活caspase-3，導(dǎo)致凋亡［12-13］。Bcl-2 家族可調(diào)節(jié)線粒體外膜的完整性和通透性，參與調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路，按其功能特點(diǎn)，可分為抗凋亡蛋白亞家族（Bcl-2、Bcl-xL 等）和促凋亡蛋白亞家族（Bax、Bak等）［14］。

Figure 9.The ratios of p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR in the Panc-1 cells of different groups.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs pEGFP-Rip2 group.圖9 各組Panc-1細(xì)胞p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值

本研究發(fā)現(xiàn)，pEGFP-Rip2 組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組和 pEGFP-C2 組，而 pEGFP-Rip2+3-MA 細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，說明抑制細(xì)胞自噬可促進(jìn)Rip2 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了探究其作用機(jī)制，我們檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，pEGFPRip2組細(xì)胞Fas、Bax 和胞漿Cyt-c蛋白水平顯著高于對(duì)照組和pEGFP-C2 組，Bcl-2 蛋白表達(dá)則顯著減少，而pEGFP-Rip2+3-MA組細(xì)胞Fas、Bax和胞漿Cyt-c蛋白水平進(jìn)一步升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步下降。同時(shí)，檢測(cè)各組細(xì)胞caspase-8、9、-3 的活性，結(jié)果顯示，pEGFP-Rip2 組細(xì)胞caspase-8、-9、-3 的活性顯著高于對(duì)照組和pEGFP-C2 組，而pEGFP-Rip2+3-MA 組細(xì)胞 caspase-8、-9、-3 的活性進(jìn)一步升高。以上結(jié)果證實(shí)，抑制細(xì)胞自噬可促進(jìn)Rip2 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與進(jìn)一步激活內(nèi)、外源性凋亡途徑有關(guān)。

眾所周知，自噬發(fā)生時(shí)beclin-1 蛋白表達(dá)通常會(huì)增多，這種蛋白是誘發(fā)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白之一［15］。此外，LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅰ分布于胞漿中，Atg7 激活LC3-Ⅰ，使LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合而成為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜上，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平可以在一定程度上反映自噬體的數(shù)量［16］。目前透射電鏡被認(rèn)為是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，pEGFP-Rip2組細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平顯著高于對(duì)照組和pEGFP-C2 組；而pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組細(xì)胞 beclin-1 和 LC3-Ⅱ蛋白水平進(jìn)一步升高。同時(shí)，在透射電鏡下觀察到，pEGFP-Rip2 組細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量顯著增多；而pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量較pEGFP-Rip2 組進(jìn)一步增多。以上結(jié)果說明，用ZVAD-FMK 抑制細(xì)胞凋亡可促進(jìn)Rip2 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

PI3K/Akt/mTOR 通路是目前唯一已知的自噬抑制信號(hào)通路。PI3K是一種廣泛存在于多種細(xì)胞中的脂質(zhì)激酶。在受到來自酪氨酸激酶等信號(hào)刺激后，PI3K 將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3），PI3K 可以與 Akt 的 N 端 PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在 3-磷酸肌醇依賴性激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1）的輔助下使Akt 活化。mTOR 是活化后的Akt 底物，活化的 Akt 可以使 mTOR 磷酸化，激活mTOR，從而抑制自噬［17-18］。本研究結(jié)果顯示，pEGFPRip2 組細(xì)胞p-Akt 和p-mTOR 蛋白水平顯著低于對(duì)照組和pEGFP-C2 組，而總Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)變化卻不顯著；pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK組細(xì)胞p-Akt和p-mTOR 蛋白水平則進(jìn)一步下降，但總mTOR 和Akt 蛋白表達(dá)未見顯著變化。以上結(jié)果說明，Z-VAD-FMK抑制凋亡可促進(jìn)Rip2誘導(dǎo)的自噬，其作用機(jī)制可能與進(jìn)一步抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的活性有關(guān)。

綜上所述，在人胰腺癌細(xì)胞中，抑制自噬可增強(qiáng)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)進(jìn)一步激活內(nèi)、外源性凋亡途徑；而抑制凋亡可促進(jìn)Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并進(jìn)一步下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 通路的活性。因此，本研究證實(shí)了Rip2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡具有交互拮抗作用。這些結(jié)果為尋找治療胰腺癌的新靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。