右美托咪定術(shù)中干預(yù)對老年小鼠圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙的影響及其可能機(jī)制*

于文華， 孟馥芬， 姜莉莉， 閆 睿， 劉亞華

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，新疆烏魯木齊830011）

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND）是指圍術(shù)期患者的認(rèn)知功能變化，在老年（＞60歲）患者的發(fā)生率遠(yuǎn)大于非老年的成年患者，且隨著年齡的增大而增高［1-2］。PND 導(dǎo)致的注意力、精神狀態(tài)和意識水平的變化多出現(xiàn)在術(shù)后早期到術(shù)后數(shù)月［3］，并可能持續(xù)影響患者生活質(zhì)量和疾病預(yù)后，甚至導(dǎo)致老年癡呆的發(fā)生［4］。降低老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率，在延長其生命的同時改善其生存質(zhì)量是手術(shù)預(yù)后面臨的挑戰(zhàn)。PND 的病因尚未明確，誘因較多，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，治療手段有限，并往往被醫(yī)護(hù)人員忽視，得不到及時的確診和有效的干預(yù)［5］。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）與其它通過下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic region，VLPO）神經(jīng)元環(huán)路下游γ-氨基丁酸受體發(fā)揮作用的鎮(zhèn)靜藥物不同，是通過VLPO調(diào)節(jié)覺醒以發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用的麻醉輔助藥物［6］。DEX 可在神經(jīng)系統(tǒng)遭受創(chuàng)傷時抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［7］。也有研究報道，DEX 可降低老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙［8］，但其具體機(jī)制并不清楚。因此，本研究建立PND 小鼠模型，探討術(shù)中DEX 干預(yù)對老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的改善作用及其機(jī)制，以期為今后DEX應(yīng)用于老年患者手術(shù)的麻醉過程提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 儀器與器材

DEX 注射液購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、焦油紫染液、抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體、生物素標(biāo)記的II 抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素、辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗和一步法TUNEL染色試劑盒（綠色熒光）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）抗體購自Sigma；抗白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體購自Novus；抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 cleaved caspase-3 抗體購自 Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)動物、手術(shù)模型及分組處理

60 只 14 月齡 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠（體重28～32 g）購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心［SCXK（新）2018-0001］并飼養(yǎng)在SPF 級動物房［SYXK（新）2018-0003］中，小鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水。所有實(shí)驗(yàn)開展前，小鼠均在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)1 周。小鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、手術(shù)（surgery）組和DEX 干預(yù)組（DEX 組），每組20 只小鼠。左肝外葉切除術(shù)組小鼠通過術(shù)前吸入0.3%異氟烷麻醉，在術(shù)中利用0.1%異氟烷0.3 L/min 維持麻醉，并進(jìn)行左肝外葉切除術(shù)；DEX 干預(yù)組小鼠在手術(shù)組的基礎(chǔ)上，在術(shù)中增加DEX（15 μg/kg，腹腔注射）［9］；假手術(shù)組麻醉方式同手術(shù)組，僅開腹，但不進(jìn)行左肝外葉切除術(shù)。術(shù)后1～3 d 注射青霉素預(yù)防切口感染，術(shù)后2 周小鼠進(jìn)行后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后小鼠無死亡現(xiàn)象。

3 方法

3.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 通過水迷宮裝置（直徑120 cm，高50 cm；ACT-200A 型，Coulbourn）對小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測試。注入水（恒溫25℃，水深25 cm），調(diào)整平臺低于水面1 cm，小鼠被放置在一個隨機(jī)的象限中。實(shí)驗(yàn)開始前1 d訓(xùn)練小鼠站臺，隨后在實(shí)驗(yàn)開始的1～5 d記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），并在第6 天沉降平臺至水池底部，記錄小鼠在平臺所在象限的停留時間及第1 次進(jìn)入平臺所在象限所用時間。實(shí)驗(yàn)期間保持安靜無人的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。采用裝置自帶視頻跟蹤軟件輸出小鼠的運(yùn)動軌跡。

3.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 通過Y迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（水平三臂，長 30 cm，寬 6 cm，高 15 cm，各臂夾角為 120°；RD1102-YM-M 型，上海移數(shù)信息科技有限公司）統(tǒng)計小鼠自發(fā)交替率研究其空間認(rèn)知能力。將小鼠放置任意一個臂末端，通過自帶攝像裝置記錄10 min內(nèi)小鼠進(jìn)入各個臂的順序。一個自發(fā)的交替被定義為連續(xù)選擇進(jìn)入3 個不同的區(qū)域。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用清水徹底清洗迷宮，去除殘留的氣味，然后進(jìn)行下個小鼠實(shí)驗(yàn)。

3.3 電生理記錄 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組任取10只小鼠，斷頸，快速取出完整腦組織并迅速置于O2和CO2混合的切片液中并切取35 μm 腦片，隨后迅速轉(zhuǎn)移至氧飽和的人工腦脊液（NaCl 124 mmol/L，KH2PO41.25 mmol/L，KCl 2.69 mmol/L，MgSO42 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L）中。用微分干涉相差顯微鏡（DMi8-M型，Leica）觀察海馬并找到CA1 區(qū)。以Axoclamp-2B膜片鉗給予刺激，記錄場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）以反映長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP），取1/3 fEPSP 最大反應(yīng)刺激作為基線刺激強(qiáng)度，基線至少記錄10 min，記錄時連續(xù)用O2和CO2飽和的人工腦脊液灌流。

3.4 小鼠腦組織分離 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將每組剩余的10 只小鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，快速取出完整腦組織，在冰上快速分離出雙側(cè)海馬組織。海馬組織分成3 部分，一部分直接凍存在-80℃冰箱用于后續(xù)Western blot 檢測，另一部分用于制作石蠟組織并切成6 μm 厚度石蠟切片；最后一部分用制作冰凍組織并切成8 μm 厚度冰凍切片。

3.5 尼氏染色 石蠟?zāi)X片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，用1%焦油紫30 min。自來水沖洗1 min，70%乙醇分化30 s，常規(guī)脫水、透明、封片后，在顯微鏡（DSX510型，Olympus）下觀察，并隨機(jī)選取5 個視野拍照，用ImageJ軟件對尼氏體計數(shù)。

3.6 免疫組化染色 石蠟?zāi)X片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，用 3% 的 H2O2處理 5 min，PBS 浸泡 5 min，用 0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)。用10%山羊血清在37℃下封閉腦片1 h 后，滴加I 抗（抗GFAP 抗體，1∶500）并在37℃下孵育2 h，PBS沖洗腦片2次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的II抗（1∶200）并在37℃孵育20 min，PBS沖洗腦片2次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（1∶200）并在37℃孵育20 min，PBS 沖洗腦片 2 次，最后以 DAB 溶液顯色 5 min，自來水沖洗 2 min。在顯微鏡（DSX510 型，Olympus）下觀察，并隨機(jī)選取5 個視野拍照，通過ImageJ軟件統(tǒng)計陽性信號。

3.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 在室溫下，用0.5% Triton X-100 溶液處理冰凍腦片2 min，用10%山羊血清在37℃下封閉1 h 后，滴加I抗（抗NeuN 抗體，1∶1 500）孵育2 h。PBS 沖洗腦片2 次，每次5 min，滴加FITC標(biāo)記的II 抗（1∶500），暗室室溫孵育1 h。在熒光顯微鏡（Q-PHASE 型，TESCAN）下觀察，隨機(jī)選取5 個視野，通過ImageJ軟件統(tǒng)計陽性信號。

3.8 TUNEL 染色 在室溫下，用4%多聚甲醛溶液固定冰凍腦片10 min，PBS 沖洗腦片2 次，每次5 min，用 0.5% Triton X-100 溶液處理 2 min，PBS 沖洗腦片2次，每次5 min，滴加50 μL TUNEL檢測液并在暗室室溫孵育1 h。并用DAPI 復(fù)染5 min，在熒光顯微鏡（Q-PHASE 型，TESCAN）下觀察，隨機(jī)選取5 個視野，用ImageJ軟件對TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)。

3.9 Western blot 用RIPA 裂解液裂解海馬組織并提取全蛋白，蛋白用BCA 法定量，取40 μg 蛋白樣品進(jìn)行電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，隨后加I抗（抗GFAP 抗體，1∶2 000；抗βactin 抗體，1∶4 500；抗 IL-6、TNF-α 和cleaved caspase-3 抗體，1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST 洗膜2 次，每次10 min，室溫孵育 HRP 標(biāo)記的 II 抗 1 h，TBST 洗膜 2次，每次5 min，暗室ECL 法顯影于膠片。膠片進(jìn)行掃描后，以β-actin為參照，用ImageJ軟件量化目的蛋白表達(dá)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM），使用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析及Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后認(rèn)知行為的影響

各組小鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動軌跡見圖1A。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)第2～5 天的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01），在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)第6 天滯留于平臺所在象限的時間顯著縮短（P＜0.01），且首次進(jìn)入平臺所在象限的潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與手術(shù)組比較，DEX干預(yù)組小鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)第2～5 天的避潛伏期顯著縮短（P＜0.01），在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第6天滯留于平臺所在象限的時間顯著延長（P＜0.01），且首次進(jìn)入平臺所在象限的潛伏期顯著縮短（P＜0.01），見圖1B～D。在Y 迷宮實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠自發(fā)性交替率顯著降低（P＜0.01）；DEX 干預(yù)組小鼠自發(fā)性交替率較手術(shù)組小鼠顯著升高（P＜0.01），見圖1E。

2 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

尼氏染色結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠海馬CA1 區(qū)單位面積內(nèi)尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)相比于假手術(shù)組顯著減少（P＜0.01），而術(shù)中DEX 干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)這些改變（P＜0.01），見圖2A。NeuN 免疫熒光結(jié)果顯示，DEX 干預(yù)組海馬NeuN 陽性細(xì)胞數(shù)相比于手術(shù)組顯著增加（P＜0.01），見圖2B。

3 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬LTP的影響

通過膜片鉗記錄小鼠海馬CA1 區(qū)LTP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在突觸前給予高頻電刺激后，相比于假手術(shù)組，手術(shù)組小鼠單個刺激引起的突觸后誘發(fā)電位幅度降低，DEX 干預(yù)組電位幅度基本與假手術(shù)組相近；通過統(tǒng)計，DEX 干預(yù)組fEPSP 斜率顯著高于手術(shù)組（P＜0.01），見圖3。

Figure 1.Effects of dexmedetomidine（DEX）on postoperative cognitive behavior in aged mice.A:water maze trajectory maps；B:escape latency in water maze experiment；C:residence time in the quadrant of platform in water maze experiment；D:exploration latency in water maze experiment；E:Y maze spontaneous alternation rate.Mean±SEM. n=20.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖1 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后認(rèn)知行為的影響

Figure 2.Protective effect of dexmedetomidine（DEX）on hippocampal neurons in aged mice after operation.A:Nissl staining results of hippocampal CA1 region；B:immunofluorescence results of NeuN protein in hippocampal CA1 region.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖2 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

Figure 3.Effect of dexmedetomidine（DEX）on long-term potentiation（LTP）in hippocampus of aged mice after operation.A:diagrams of LTP changes in hippocampal CA1 region；B:scatter plot of field excitatory postsynaptic potential（fEPSP）slope at different time points.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖3 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬LTP的影響

4 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，GFAP 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與手術(shù)組比較，DEX 干預(yù)組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞減少，GFAP 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖4A、B。TUNEL 染色結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠海馬TUNEL 陽性染色神經(jīng)元顯著增多（P＜0.01），而DEX 干預(yù)可顯著降低老年小鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元凋亡率（P＜0.01），見圖4C。

5 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬組織炎癥因子和凋亡因子的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6 及cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而DEX 干預(yù)能顯著降低上述蛋白水平（P＜0.01），見圖5。

討 論

PND 是老年患者術(shù)后常見的并發(fā)癥之一［1-3，8］。PND 的發(fā)生是多種因素造成的，主要與膽堿能系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激及炎癥細(xì)胞因子有關(guān)［10］。對PND 避免和防范是臨床老年患者手術(shù)過程中亟待解決的問題。本研究在C57BL/6J老年小鼠左肝外葉切除術(shù)中給予DEX 干預(yù)，并利用Y 迷宮和水迷宮評價動物記憶情況。其中Y 迷宮測試可區(qū)分工作記憶和參考記憶情況；而水迷宮中的穿越原平臺位置次數(shù)反映工作記憶中對獲取有效信息的能力和記憶的保持能力。本研究的行為學(xué)結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠工作記憶發(fā)生障礙；與手術(shù)組比較，DEX 干預(yù)組工作記憶錯誤次數(shù)明顯減少，總錯誤次數(shù)明顯減少，穿臺次數(shù)明顯增加，表明術(shù)中DEX 干預(yù)可顯著改善老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能。LTP 是評價學(xué)習(xí)記憶及突觸可塑性的常用生理指標(biāo)。本研究通過膜片鉗技術(shù)記錄了術(shù)中DEX 干預(yù)對老年小鼠海馬CA1 區(qū)LTP 的影響，結(jié)果顯示術(shù)中DEX干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)術(shù)后引起的突觸后電位幅度減小。

DEX 可以改善老年患者全麻術(shù)后認(rèn)知功能［8，11］，但其具體機(jī)制仍不明晰。已有研究通過對行下脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)的老年小鼠的血腦屏障和海馬進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠術(shù)后表現(xiàn)為血腦屏障破壞和海馬受損［12］。海馬受損將導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［13-14］。海馬位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，在記憶和認(rèn)知等方面有重要作用，尤其與短時記憶以及對環(huán)境的感知有著非常明確的關(guān)系［15］。已有研究表明，在老年小鼠創(chuàng)傷術(shù)后海馬神經(jīng)元會發(fā)生丟失和凋亡，海馬神經(jīng)元創(chuàng)傷是認(rèn)知功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵步驟［16］。本研究結(jié)果顯示，術(shù)中DEX 干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)手術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬神經(jīng)元丟失和凋亡。手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及海馬組織促炎因子TNF-α 和IL-1β 生成增多［17-18］。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和神經(jīng)炎癥是誘導(dǎo)PND 發(fā)生的必要條件［17-18］。因此，我們進(jìn)一步思考術(shù)中DEX干預(yù)對術(shù)后老年小鼠認(rèn)知功能的改善是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。本研究通過免疫熒光、免疫組化和Western blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了術(shù)中DEX干預(yù)可抑制手術(shù)后老年小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子TNF-α和IL-6的生成。

Figure 4.Effects of dexmedetomidine（DEX）on the activation of hippocampal astrocytes in aged mice after operation.A:immunohistochemical staining for GFAP in hippocampus of aged mice；B:Western blot results of GFAP protein in hippocampus of aged mice；C:TUNEL immunofluorescence staining results and apoptotic rate analysis.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖4 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

Figure 5.Effects of dexmedetomidine（DEX）on the levels of inflammatory and apoptotic factors in hippocampal tissues of aged mice after operation.Mean±SEM. n=10，##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖5 右美托咪定對老年小鼠術(shù)后海馬組織炎癥因子和凋亡因子的影響

綜上所述，本研究證明了術(shù)中DEX 干預(yù)可抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元凋亡，從而保護(hù)海馬神經(jīng)元，達(dá)到改善老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的作用。