大麻素受體2激動劑AM1241對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響

龍翠珍，舒遠(yuǎn)輝，何萍，2，王豫萍，2△

肝纖維化是彌漫性肝損傷后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)［1］。肝纖維化的實(shí)質(zhì)是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成增多而降解不足，并在肝臟過度沉積，此過程中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化是中心環(huán)節(jié)［2］。HSCs 存在于竇間隙Disse 腔內(nèi)，正常情況下HSCs 表現(xiàn)為富含維生素A脂滴的靜止型［3］。在慢性肝損傷的刺激下，HSCs 表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚停涮卣鳛楸磉_(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），分泌與合成ECM，自分泌或旁分泌轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)HSCs的活化而加重肝纖維化［4-5］。因此，抑制HSCs 增殖與活化，促進(jìn)其凋亡已成為當(dāng)前抗肝纖維化治療的主要策略［6］。

近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）在肝纖維化及肝硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是抗肝纖維化的潛在治療靶點(diǎn)［7］。大麻素受體（cannabinoid receptor ，CB）2是ECS 的重要組成部分之一，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化等作用［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CB2 受體激動劑AM1241 能減輕四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，降低肝組織血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）蛋白的表達(dá)水平，提示激活CB2 可改善肝纖維化［10］。但是有關(guān)CB2 受體激動劑AM1241 對體外培養(yǎng)的HSCs 增殖、活化與凋亡的影響鮮有報道。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)采用葡萄糖氧化酶刺激大鼠肝星狀細(xì)胞（HSCT6）建立氧化應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)AM1241能發(fā)揮抗氧化作用抑制HSC-T6 的增殖與活化［11］。本研究采用TGF-β1 誘導(dǎo)HSC-T6 活化，進(jìn)一步探討AM1241 對HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6購自昆明細(xì)胞庫；胎牛血清（FBS）購自以色列Biological Industries 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司；重組人TGF-β1 購自美國Peprotech 公司；AM1241 購自美國Selleck 公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；全蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠GAPDH抗體、兔抗鼠α-SMA抗體、兔抗鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）1+JNK2+JNK3 抗體、兔抗鼠JNK1+JNK2+JNK3（磷酸化T183+T183+T221，p-JNK）抗體均購自美國Abcam公司；兔抗鼠bFGF 抗體購自愛必信公司；兔抗鼠Bax 多克隆抗體購自沈陽萬類公司；兔抗鼠cleaved caspase-3 單克隆抗體購自美國CST 公司；山羊抗兔IgG（H+L）HRP 購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光液購自美國Millipore 公司；ELX800酶標(biāo)儀、BIO-RAD全套電泳裝置購自美國BIO-RAD公司；Chemi Scope Mini 3300 化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；NaviosTM分析型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6 采用含90% 高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素混合液+1%L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度為70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 CCK-8 法測定AM1241 對HSC-T6 增殖能力的影響 取對數(shù)生長期HSC-T6 以4×103個/孔接種于96 孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組（空白培養(yǎng)基）、陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1組（5 μg/L TGF-β1）及20、40、80、160 μmol/L AM1241組（5 μg/L TGF-β1+20、40、80、160 μmol/L AM1241）；每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。吸掉舊培養(yǎng)基，用含1%FBS 的高糖DMEM 培 養(yǎng) 液 洗1 次，加 入100 μL/孔 含1%FBS 的 高 糖DMEM培養(yǎng)液，再加入10 μL/孔CCK-8試劑，37 ℃、5%CO2孵育1.5 h，采用ELX800 酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測吸光度（A）值。計算AM1241 系列濃度梯度對HSC-T6 的生長抑 制 率，細(xì) 胞 生 長 抑 制 率=［1-（A藥物-A空白）/（A0-A空白）］×100%，并采用GraphPad Prism 5.0 軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測AM1241對HSC-T6凋亡的影響 取對數(shù)生長期HSC-T6分為陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1組（5 μg/L TGF-β1）及30、60 μmol/L AM1241 組（5 μg/L TGFβ1+30、60 μmol/L AM1241），培養(yǎng)48 h。用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，計數(shù)，取2×106個/mL 的細(xì)胞懸液100 μL 于流式管內(nèi)，分別加入5 μL 的Annexin V FITC 和PI，避光孵育15 min，后加入400 μL的緩沖液，于NaviosTM分析型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot 檢測α-SMA、bFGF、Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白的表達(dá) 將對數(shù)生長期HSC-T6分成陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1 組（5 μg/L TGF-β1）和27 μmol/L AM1241 組（5 μg/L TGF-β1+27 μmol/L AM1241）。采用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜、5%脫脂奶粉封閉1.5 h，膜條4 ℃孵育一抗GAPDH 抗體（1∶10 000）、α-SMA抗體（1∶5 000）、bFGF抗體（1∶300）、Bax抗體（1∶500）、cleaved caspase-3 抗體（1∶1 000）、p-JNK 抗體（1∶1 500）、JNK抗體（1∶1 000）過夜，次日洗膜，室溫孵育山羊抗兔IgG（H+L）HRP 1.5 h，洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并曝光。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算各目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度AM1241 對TGF-β1 誘導(dǎo)后HSC-T6增殖能力的影響 TGF-β1 組細(xì)胞增殖能力與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與TGF-β1 組比較，AM1241 可抑制HSC-T6 增殖能力，且隨著AM1241濃度的升高，細(xì)胞增殖能力逐漸降低，細(xì)胞生長抑制率逐漸升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。AM1241的IC50為27 μmol/L。

Tab.1 Effects of different concentrations of AM1241 on the proliferation of HSC-T6 cells表1 實(shí)驗(yàn)各組對HSC-T6增殖能力的影響（n=3）

Tab.1 Effects of different concentrations of AM1241 on the proliferation of HSC-T6 cells表1 實(shí)驗(yàn)各組對HSC-T6增殖能力的影響（n=3）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，c與TGF-β1組比較，d與20 μmol/L AM1241組比較，e與40 μmol/L AM1241組比較，f與80 μmol/L AM1241組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組TGF-β1組20 μmol/L AM1241組40 μmol/L AM1241組80 μmol/L AM1241組160 μmol/L AM1241組F A值0.197±0.008 1.033±0.103a 1.090±0.009a 0.756±0.015abc 0.489±0.015abcd 0.410±0.026abcde 0.353±0.006abcdef 1 827.561＊細(xì)胞生長抑制率（%）--0 37.379±1.486c 67.336±1.887cd 76.017±2.293cde 82.041±0.336cdef 713.305＊

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測AM1241 對TGF-β1 誘導(dǎo)后HSC-T6 凋亡的影響 陰性對照組、TGF-β1 組及30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6 凋 亡率 分 別 為（7.983±2.129）%、（8.527±2.089）%、（30.973±1.732）%、（59.200±9.224）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=72.387，P＜0.05）。TGF-β1組細(xì)胞凋亡率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與TGF-β1 組比較，30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6 凋亡率均明顯上 升，且60 μmol/L AM1241 組 高 于30 μmol/L AM1241組（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Detection of apoptosis by flow cytometry in HSC-T6 cells of each group圖1 流式檢測各組HSC-T6的凋亡情況

2.3 AM1241 對HSC-T6 活化的影響 TGF-β1 組α-SMA 和bFGF 蛋白表達(dá)水平較陰性對照組升高（P＜0.05）；27 μmol/L AM1241 組α-SMA 和bFGF 蛋白表達(dá)水平較TGF-β1 組明顯降低（P＜0.05），見圖2、表2。

cells of each group圖2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達(dá)情況

Tab.2 Comparison of relative expression levels of α-SMA and bFGF proteins in HSC-T6 cells of each group表2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達(dá)水平的比較（n=3）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of α-SMA and bFGF proteins in HSC-T6 cells of each group表2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達(dá)水平的比較（n=3）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別陰性對照組TGF-β1組27 μmol/L AM1241組F n3 3 3 α-SMA蛋白0.397±0.073 0.763±0.130a 0.150±0.117ab 23.838＊bFGF蛋白0.246±0.096 0.378±0.088a 0.238±0.061ab 4.527＊

2.4 AM1241 對TGF- β1 誘 導(dǎo) 的HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白表達(dá)的影響 TGF-β1組Bax、cleaved caspase-3 和p-JNK 蛋白表達(dá)水平與陰性對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；27 μmol/L AM1241 組Bax、cleaved caspase-3、p-JNK 蛋白表達(dá)水平較TGF-β1 組升高（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 Expressions of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells圖3 各組HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白表達(dá)情況

Tab.3 Relative expression levels of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6Bax、cleaved caspase-3和p-JNK蛋白表達(dá)水平的比較 （n=3）

Tab.3 Relative expression levels of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6Bax、cleaved caspase-3和p-JNK蛋白表達(dá)水平的比較 （n=3）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別陰性對照組TGF-β1組27 μmol/L AM1241組F Bax蛋白0.261±0.217 0.245±0.050 0.342±0.020ab 7.327＊cleaved caspase-3蛋白0.548±0.039 0.483±0.074 0.974±0.346ab 6.754＊p-JNK蛋白0.491±0.180 0.587±0.089 0.894±0.049ab 9.316＊

3 討論

肝纖維化是持續(xù)性肝損傷后肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理生理過程［12］。HSCs 是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。若能抑制HSCs的活化與增殖，理論上可部分逆轉(zhuǎn)或者減慢肝纖維化的進(jìn)展［6，12］。TGF-β1 是目前已知最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子之一，是激活靜態(tài)HSCs的主要因子［5］。鄭素軍等［13］研究顯示，以10 μg/L TGF-β1分別刺激HSC-T6 24、36 h，可增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，并上調(diào)膠原和α-SMA 蛋白表達(dá)水平，提示TGF-β1 可促進(jìn)HSC-T6 的增殖與活化。本研究結(jié)果顯示，以5 μg/L TGF-β1 刺激HSC-T6 24 h 后，其α-SMA 與bFGF 蛋白表達(dá)水平較陰性對照組明顯升高，提示TGF-β1可促進(jìn)HSC-T6活化，滿足本研究對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷囊?。但HSC-T6 增殖能力、細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平與陰性對照組無明顯差異，提示TGF-β1對HSC-T6增殖、凋亡均無明顯影響，與鄭素軍等［13］研究結(jié)果不同，可能與TGF-β1 濃度及HSC-T6 狀態(tài)、生長環(huán)境與培養(yǎng)方式不同有關(guān)。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由CB、內(nèi)源性配體及與配體合成、降解相關(guān)的酶類共同構(gòu)成［14］。CB包括CB1和CB2兩種，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其中CB1主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CB2 主要分布在外周免疫細(xì)胞中［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4或乙醇誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型中，拮抗CB2可加重肝纖維化，激活CB2可有效抑制肝纖維化［15］。本研究結(jié)果顯示，CB2 受體激動劑AM1241可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖能力，且呈劑量依賴性，提示激活CB2可抑制體外培養(yǎng)的HSC-T6增殖，與張自力等［16］研究結(jié)果一致。α-SMA、bFGF表達(dá)水平可反映HSCs細(xì)胞活化程度。本研究結(jié)果顯示，AM1241可明顯下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6 α-SMA、bFGF 蛋 白 表 達(dá) 水平，提示AM1241可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的活化及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，也證實(shí)激活CB2 可產(chǎn)生抗肝纖維化的作用。

目前AM1241 對活化的HSCs 凋亡的影響及其機(jī)制鮮有報道。有研究顯示，在肝纖維化動物模型中，CB 可能參與HSCs 內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的調(diào)控［16-17］。JNK 是MAPK 的家族成員之一，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞分化、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程［18］。JNK通路的促凋亡作用依賴于c-fos、c-Jun等細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的活化，活化的c-fos、c-Jun又可調(diào)控Bax、Bcl-2 等多種凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［19-20］。Bax 和Bcl-2 基因的表達(dá)產(chǎn)物均定位于線粒體膜，Bax 增加細(xì)胞色素C 的釋放，Bcl-2抑制細(xì)胞色素C的釋放，從線粒體釋放的細(xì)胞色素C 能促進(jìn)caspase-3 裂解并啟動細(xì)胞凋亡［21］。caspase-3是凋亡過程的主要效應(yīng)因子，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段［22］。本研究結(jié)果顯示，與TGF-β1 組比較，30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6凋亡率均明顯上升，且60 μmol/L AM1241組高于30 μmol/L AM1241組；Western blot結(jié)果顯示，27 μmol/L AM1241 組HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平較TGF-β1 組升高，提示AM1241 可促進(jìn)HSCT6 凋亡。同時，27 μmol/L AM1241 組HSC-T6 p-JNK 蛋白表達(dá)水平較TGF-β1 組明顯上調(diào)，提示AM1241 對HSC-T6 的促凋亡作用可能與JNK 通路相關(guān)。

綜上所述，CB2 受體激動劑AM1241 可抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的HSC-T6 增殖與活化，促進(jìn)HSC-T6凋亡，且其作用機(jī)制可能與JNK通路有關(guān)。