新型冠狀病毒肺炎患者恢復(fù)期肛拭子中SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果評價(jià)

汪小五，朱義朗，李團(tuán)團(tuán)，高勇

2019 年12 月，我國湖北省武漢市出現(xiàn)了41 例不明原因肺炎患者，中國工程院院士徐建國博士領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)宣布引起此次肺炎暴發(fā)的為一種新型冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織（WHO）暫定其為2019 年新型冠狀病毒［2019-nCoV，后更新為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）］［1］。2020 年1 月3 日，在1例患者的支氣管肺泡灌洗液樣本中發(fā)現(xiàn)了SARSCoV-2，其被認(rèn)為是導(dǎo)致新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的原因［2］。SARS-CoV-2 主要通過呼吸道傳播，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）技術(shù)是目前COVID-19 患者呼吸道標(biāo)本核酸檢測的主要方法［3］。有研究報(bào)道，COVID-19 患者糞便標(biāo)本SARSCoV-2 核酸檢測顯陰性的時(shí)間比呼吸道標(biāo)本晚［4］。因此，糞便標(biāo)本用于SARS-CoV-2 的核酸檢測不應(yīng)被忽略。本研究收集了本院住院治療恢復(fù)期COVID-19 患者痰液、咽拭子和肛拭子3 種標(biāo)本，同期進(jìn)行SARS-CoV-2 核酸檢測，并分析其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月24日—2月17日于本院確診的COVID-19 患者50 例，其中男24 例，女26 例，年齡1～82歲，平均（42.56±17.46）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》［5］。35 例（70.0%）有發(fā)熱癥狀，體溫36.3～38.9 ℃，33 例（66.0%）有咳嗽癥狀，19 例（38.0%）有咳痰癥狀，6 例（12.0%）有腹瀉。23 例（46.0%）有武漢接觸史?；颊咦≡禾鞌?shù)11～36 d，平均（22.5±8.0）d。

1.2 試劑與儀器 SARS-CoV-2 ORF1ab/N基因雙重核酸檢測試劑盒（qPCR 法）購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；SLAN96P熒光定量PCR儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；核酸提取試劑盒及自動(dòng)核酸提取儀均購自江蘇碩世生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集50例患者住院恢復(fù)期的呼吸道標(biāo)本（下呼吸道深咳痰和口咽拭子標(biāo)本）和肛拭子標(biāo)本，3種標(biāo)本同期進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測。住院恢復(fù)期指患者經(jīng)過治療后一般情況穩(wěn)定，隔日復(fù)查呼吸道標(biāo)本2次顯示SARS-CoV-2核酸檢測陰性，肺部CT明顯病灶吸收良好，癥狀好轉(zhuǎn)。痰液標(biāo)本采集：由護(hù)士于床旁，患者先漱口后深吸氣并用力咳嗽，得到的痰液（下呼吸道深咳痰）吐進(jìn)已做好標(biāo)識的標(biāo)本盒內(nèi)，蓋上蓋子擰緊密封（痰標(biāo)本應(yīng)避免混入唾液、漱口水或鼻涕等）?？谘适米訕?biāo)本的采集：患者先用清水漱口，再張口發(fā)出“啊”音，必要時(shí)可以使用壓舌板。護(hù)士使用滅菌棉簽在患者的咽側(cè)壁及咽后壁擦拭數(shù)次，再將棉簽放入采樣管中密封。肛拭子標(biāo)本的采集：使用滅菌棉簽，蘸取少量無菌生理鹽水后，插入患者的肛門2～3 cm處，再旋轉(zhuǎn)2～3圈，迅速將棉簽放入采樣管中密封。所有標(biāo)本采集完畢后，電話聯(lián)系專門運(yùn)送疑似SARS-CoV-2感染患者標(biāo)本的人員及時(shí)運(yùn)送至檢驗(yàn)科。

1.3.2 SARS-CoV-2 核酸檢測 采用qPCR 技術(shù)，針對SARS-CoV-2 基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）進(jìn)行檢測。SARS-CoV-2 核酸檢測結(jié)果判讀：（1）靶基因檢測判讀。①FAM通道檢測ORF lab基因，HEX/C通道檢測N基因；②陰性為Ct 值＞37 或未檢出；③陽性為擴(kuò)增曲線呈S 型，且Ct 值≤37；④可疑為擴(kuò)增曲線呈S 型，且37＜Ct 值＜40。（2）SARSCoV-2 檢測陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)。①同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2中2 個(gè)靶標(biāo)（ORF la/b、N）均為陽性；②單靶標(biāo)陽性患者重新采樣，重新檢測，如果仍然為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本文主要采用描述性統(tǒng)計(jì)，對正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）形式；分類變量采用例（%）形式進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 恢復(fù)期患者3 種標(biāo)本中SARS-CoV-2 核酸結(jié)果分析 本次50 例COVID-19 患者的156 份標(biāo)本包括痰液標(biāo)本41 份、咽拭子標(biāo)本55 份及肛拭子60 份，痰液、咽拭子和肛拭子標(biāo)本病毒核酸陽性率分別為19.5%、10.9%和18.3%。50 例COVID-19 患者中有痰液標(biāo)本檢測病毒核酸陽性8例，咽拭子有6例，肛拭子有10例，陽性率分別為19.5%、12.0%和20.0%，見表1。

Tab.1 Test results of SARS-CoV-2 nucleic acid in 156 samples from COVID-19 patients表1 COVID-19患者156份樣本SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果

2.2 肛拭子病毒核酸陽性患者痰液和咽拭子標(biāo)本病毒核酸檢測分析 10 例肛拭子病毒核酸檢測陽性患者同期呼吸道病毒核酸檢測分析結(jié)果見表2。在治療恢復(fù)期，10 例患者中有9 例在肛拭子病毒核酸檢測陽性時(shí)痰液或咽拭子標(biāo)本檢測已是陰性?；颊? 在入院12 d 時(shí)肺部CT 病灶有所吸收，癥狀好轉(zhuǎn)，痰液標(biāo)本未檢測核酸，咽拭子檢測呈陰性，肛拭子檢測呈陽性；入院14 d時(shí)咽拭子檢測呈陽性，肛拭子檢測呈可疑；入院16 d 和19 d 結(jié)果與入院14 d 一致，肛拭子連續(xù)2 次SARS-CoV-2 N 基因檢測陽性，即肛拭子核酸檢測判斷為陽性?；颊?0在入院15 d時(shí)，肺部CT明顯病灶吸收良好，癥狀好轉(zhuǎn)，痰液標(biāo)本核酸檢測呈陽性，咽拭子、肛拭子均呈陰性；入院17 d時(shí)，痰液和咽拭子標(biāo)本核酸檢測呈陰性，肛拭子未檢測；入院19 d 時(shí)痰液和咽拭子標(biāo)本核酸檢測均呈陰性，肛拭子核酸檢測呈陽性。其余8例患者同期3種標(biāo)本做SARS-CoV-2 核酸檢測時(shí)，呼吸道標(biāo)本核酸檢測呈陰性，而肛拭子核酸檢測均呈陽性。

Tab.2 Analysis of respiratory tract specimens of 10 cases with positive SARS-CoV-2 nucleic acid test in anal swabs表2 10例肛拭子SARS-CoV-2核酸檢測陽性患者呼吸道標(biāo)本檢測情況分析

3 討論

3.1 COVID-19患者恢復(fù)期3種標(biāo)本中SARS-CoV-2 核酸檢測結(jié)果比較 SARS-CoV-2 存在人傳人已經(jīng)被證實(shí)，有研究報(bào)道還存在無癥狀感染患者傳播［6］。為了遏制病毒蔓延，無論是對密切接觸者的大排查，還是對康復(fù)出院患者的復(fù)查都至關(guān)重要。呼吸道標(biāo)本的SARS-CoV-2 核酸檢測是COVID-19患者治療后出院和解除隔離的標(biāo)準(zhǔn)之一。有研究表明，糞便標(biāo)本中存在SARS-CoV-2顆粒［7-8］。本研究對COVID-19患者恢復(fù)期痰液、咽拭子和肛拭子3種標(biāo)本同時(shí)檢測SARS-CoV-2 核酸（ORF1ab 基因和N基因），發(fā)現(xiàn)痰液標(biāo)本病毒核酸陽性率高于咽拭子。呼吸道標(biāo)本盡量以痰液標(biāo)本為主，當(dāng)痰液標(biāo)本無法獲得時(shí)可考慮咽拭子標(biāo)本。SARS-CoV-2核酸檢測由于假陰性結(jié)果的存在，有的患者多次核酸檢測陰性后又出現(xiàn)陽性結(jié)果，因此在標(biāo)本取材時(shí)一定要按照正確的操作規(guī)范進(jìn)行。有研究報(bào)道，糞便標(biāo)本SARS-CoV-2 核酸檢測陽性率高于肛拭子［4］。本研究發(fā)現(xiàn)COVID-19患者在恢復(fù)期痰液標(biāo)本和肛拭子標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測陽性率接近。50例患者中有10 例恢復(fù)期肛拭子SARS-CoV-2 核酸檢測陽性，故患者肛拭子標(biāo)本用于病毒核酸檢測的價(jià)值應(yīng)予以重視，能獲取糞便標(biāo)本檢測核酸價(jià)值更高。

3.2 肛拭子病毒核酸陽性患者痰液和咽拭子標(biāo)本病毒核酸檢測分析 本研究中COVID-19患者住院最短11 d，最長36 d，住院期間多次檢測病毒核酸。尤其是呼吸道標(biāo)本，在患者恢復(fù)期基本上是隔天檢測病毒核酸，觀察是否轉(zhuǎn)陰，連續(xù)測得核酸陰性以及肺部CT顯示明顯好轉(zhuǎn)即可出院。俞龍等［4，8］報(bào)道糞便標(biāo)本核酸檢測陽性率高于肛拭子，由于糞便標(biāo)本處理流程比較復(fù)雜，而且同期糞便標(biāo)本可能不能及時(shí)留取，本研究只留取了肛拭子，較糞便標(biāo)本在做qPCR前處理過程簡單。本研究發(fā)現(xiàn)10例患者在恢復(fù)期SARS-CoV-2肛拭子核酸檢測呈陽性?；颊?，年齡1歲，無法自主深咳痰液做病毒核酸檢測，故采集咽拭子標(biāo)本檢測核酸；在住院第12天時(shí)同時(shí)檢測了咽拭子和肛拭子的SARS-CoV-2核酸，咽拭子呈陰性而肛拭子呈陽性；入院第12天時(shí)患者肺部CT顯示病灶有所吸收，后期是隔天采集咽拭子和肛拭子，最后咽拭子轉(zhuǎn)陰后肛拭子仍然可疑。50例患者中6例患者有腹瀉癥狀，包括患者7?；颊?0入院15 d時(shí)呼吸道標(biāo)本核酸檢測呈陽性，肛拭子呈陰性，CT顯示病灶明顯吸收；入院19 d時(shí)呼吸道標(biāo)本病毒核酸轉(zhuǎn)陰，肛拭子呈陽性，但是該患者并無腹瀉癥狀。SARS-CoV-2最主要的傳播途徑是經(jīng)呼吸道傳播［9］，至于患者出現(xiàn)肛拭子核酸檢測呈現(xiàn)陽性的原因，以及是否存在以糞-口方式傳播有待進(jìn)一步研究。WHO指出SARS-CoV-2檢測結(jié)果的臨床意義為陽性結(jié)果表明患者現(xiàn)在或過去被SARS-CoV-2感染，但不一定出現(xiàn)癥狀；陰性結(jié)果則不一定表明患者沒有被SARS-CoV-2感染。本研究發(fā)現(xiàn)在COVID-19患者治療恢復(fù)期呼吸道標(biāo)本中核酸檢測轉(zhuǎn)陰的情況下，肛拭子仍然是陽性，有的患者還有腹瀉癥狀，有的則沒有。Huang等［10］也同樣提到COVID-19部分患者有腹瀉癥狀。COVID-19患者糞便中存在SARS-CoV-2顆粒，是由于呼吸道入侵后通過消化系統(tǒng)排毒，還是由于本身對消化系統(tǒng)有損傷，均有待證明。這一檢測結(jié)果需要引起臨床的重視。應(yīng)盡可能加大力度進(jìn)行排查，防止疫情進(jìn)一步擴(kuò)大。

3.3 局限性 本研究樣本量偏小，對結(jié)果分析可能存在一定的影響。實(shí)驗(yàn)室在后期才開展的肛拭子檢測SARS-CoV-2 核酸，同一患者未進(jìn)行多次肛拭子病毒核酸檢測。如果肛拭子進(jìn)行連續(xù)2 次以上SARS-CoV-2核酸檢測將更有說服力。

綜上所述，對從COVID-19 患者糞便中檢測到SARS-CoV-2 是否具有傳染性，還須進(jìn)行病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和流行病學(xué)調(diào)查。此外，在COVID-19 患者恢復(fù)期對糞便或者肛拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測同樣值得重視。