基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測方法

馬 來，童桂香，韋信賢，曾德乾，熊建華，王 瑞，黃光華，江林源

(1.北海南方海洋生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，廣西 北海 536000；2.廣西水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021；3.南寧市武鳴區(qū)陸斡鎮(zhèn)水產畜牧獸醫(yī)站，廣西 南寧 530111；4.廣西柳州種畜場，廣西 柳州 545003)

【研究意義】蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)隸屬于腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲屬(Enterocytozoon)，是一種專性細胞內寄生的微孢子蟲，在2004年最早發(fā)現(xiàn)于泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦，于2009年首次被分離和正式命名報道，主要感染凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦等重要養(yǎng)殖蝦類，是近年來危害養(yǎng)殖對蝦的主要病原之一[1-3]。EHP可通過水平和垂直傳播，但主要經(jīng)口攝食寄生有EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或水體中的孢子體而感染[4-5]。EHP感染主要導致養(yǎng)殖對蝦生長緩慢甚至停滯，表現(xiàn)為對蝦消瘦、大小不均、重量離散[6]，且患病對蝦肝胰腺遭到破壞，免疫力降低，極易被其他病原侵染而死亡，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失[7]。目前，EHP已對全球對蝦產業(yè)構成嚴重威脅，在印度、委內瑞拉、中國、泰國、越南、馬來西亞及文萊等國家均有報道[8-12]。EHP的危害與其感染數(shù)量密切相關，輕度感染基本上不影響對蝦的生長發(fā)育，中度感染影響對蝦的營養(yǎng)吸收，嚴重感染損壞對蝦免疫系統(tǒng)[13]。因此，建立一種快速且準確的EHP定量檢測方法，在蝦苗檢疫、親蝦篩選及成蝦養(yǎng)殖疫情監(jiān)測過程中根據(jù)其定量數(shù)據(jù)及對蝦養(yǎng)殖模式制定相應措施，對有效防控由EHP引起的蝦病害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】EHP感染前期無明顯病癥，需采用組織學方法或分子生物學方法等實驗室手段檢測才能確診。鑒于此，EHP檢測方法得到快速發(fā)展，現(xiàn)已研發(fā)出多種快速檢測方法應用于實際檢測，包括原位雜交、套式PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)等[14-17]。這些檢測方法在靈敏度和便捷程度上各有優(yōu)缺點，因此如何更快速、高效、準確地檢測EHP仍有待進一步研究和探索。相對于普通PCR，熒光定量PCR的檢測和分析過程均在密閉的單管里由機器自動完成，具有自動化程度高、有效解決PCR產物污染問題及能定量檢測病原體感染等優(yōu)點[18-19]，被認為是實驗室檢測病原的最理想方法；TaqMan-MGB探針是熒光定量PCR使用的一種熒光探針，其3′端淬滅基團為不發(fā)光的MGB結合物，可實現(xiàn)高Tm值的探針長度縮短而有利于提高方法的靈敏度，且探針3′端不發(fā)光的淬滅基團與5′端報告基團在空間的位置更接近，使熒光本底降低、檢測結果分辨率更高[20-21]，因此TaqMan-MGB探針在人類及動植物各種病原體的定量檢測中得到廣泛應用[22-26]?！颈狙芯壳腥朦c】至今，國內尚未發(fā)布EHP檢測的相關標準，農業(yè)農村部在蝦肝腸胞蟲病(EHPD)監(jiān)測計劃中仍推薦采用套式PCR，但在實際檢測工作中，套式PCR存在操作繁瑣、檢測時間長和不能定量等缺點，無法滿足對EHP進行快速定量檢測的需求。鑒于TaqMan-MGB探針應用于熒光定量PCR的優(yōu)勢，將其應用于EHP定量檢測必將有助于實現(xiàn)EHPD的快速診斷及有效防控?！緮M解決的關鍵問題】建立一種基于TaqMan-MGB探針的EHP熒光定量PCR檢測方法，以提高檢測靈敏度及其效率，為EHP快速定量檢測及實時監(jiān)測提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EHP、蝦虹彩病毒(SIV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)、哈維弧菌(Vibrioharveyi)和創(chuàng)傷弧菌(V.vnlnificus)的陽性材料均由廣西水產遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室保存提供；健康無EHP感染凡納濱對蝦采自廣西水產科學研究院SPF凡納濱對蝦良種場；276份蝦樣品采自廣西北海、欽州、防城港等地養(yǎng)殖場，其中2018和2019年分別收集142和134份。動物組織基因組DNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker和氨芐青霉素購自北京艾德萊生物技術有限公司；pMD18-T載體克隆試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。熒光定量PCR儀(Mx3005P)為安捷倫公司產品。

1.2 引物及TaqMan-MGB探針設計與合成

編碼核糖體小亞基的基因序列區(qū)(SSU rDNA)包含保守區(qū)和高變區(qū)，其中保守區(qū)序列進化緩慢且相對保守，常被用作寄生蟲檢測的靶基因[27]；葉鍵等[28]研究表明，SSU rDNA基因較孢子壁蛋白基因(SWP)更適合作為檢測EHP的靶基因。因此，按熒光定量PCR擴增引物和TaqMan-MGB探針的設計原則，采用Primer Express 3.0在SSU rDNA基因(KF362129)保守區(qū)域設計多組特異性擴增引物和TaqMan-MGB探針，其中探針5′端標記熒光染料FAM、3′端標記MGB基團，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，驗證其特異性后委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。經(jīng)試驗初篩，選擇一套效果較好的擴增引物及TaqMan-MGB探針(表1)用于EHP熒光定量PCR檢測方法的建立。

表1 熒光定量PCR擴增引物及TaqMan-MGB探針信息

1.3 病原DNA提取

取30 mg陽性病料組織，按照動物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取蝦常見病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA，最后加60.0 μl洗脫緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組質粒標準品制備

以EHP的DNA為模板，滅菌水為空白對照，進行熒光定量PCR檢測。在20.0 μl反應體系中加入2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各0.4 μl，EHP-qP66(10 μmol/L)0.4 μl，DNA模板2.0 μl，滅菌水補足至20.0 μl。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，進行40個循環(huán)；在60 ℃結束時收集熒光信號。熒光定量PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，制備重組質粒pMD18-T-SSUEHP，并進行PCR及測序鑒定。提取重組質粒pMD18-T-SSUEHP，用核酸蛋白分析儀測定其濃度并轉換為拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋至1.0×109～1.0×100拷貝/μl作為標準品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR反應體系優(yōu)化

以3個梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl)的標準品DNA為模板，反應體系中其他成分濃度不變，將上、下游引物濃度以0.1 μmol/L遞增設為0.1～0.8 μmol/L，根據(jù)擴增反應的循環(huán)閾值(Ct)和擴增曲線的熒光信號強度(ΔRn)選擇最佳引物濃度。同時，以3個梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl)的標準品DNA為模板，反應體系中其他成分濃度不變，將TaqMan-MGB探針濃度以0.1 μmol/L遞增設為0.1～0.8 μmol/L，根據(jù)擴增反應的Ct值和ΔRn選擇最佳探針濃度。

1.6 標準曲線建立及敏感性試驗

以10個梯度(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)的標準品DNA為模板，采用優(yōu)化后熒光定量PCR進行檢測；利用數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，建立起始模板拷貝數(shù)(x)對數(shù)與Ct值(y)間的標準曲線和線性回歸方程，并根據(jù)各標準品DNA的擴增結果判斷該方法的定量范圍和敏感性。

1.7 特異性試驗

分別以EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量PCR進行檢測，評價其特異性。

1.8 重復性試驗

選取3個梯度(1.0×107、1.0×105和1.0×103拷貝/μl)的標準品DNA為模板，在間隔第7和14天分別進行重復試驗，每個梯度設3個平行，記錄各次試驗的Ct值，分析組內及組間的Ct值變異系數(shù)，檢測標準品的穩(wěn)定性及該方法的重復性。

1.9 熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

按1.3的方法提取EHP陽性病料組織DNA，以10倍梯度稀釋(100～10-5)，取2.0 μl各梯度DNA為模板分別采用優(yōu)化后的熒光定量PCR和農業(yè)農村部EHP監(jiān)測計劃推薦的套式PCR進行檢測，比較其敏感性。

1.10 熒光定量PCR和套式PCR檢測臨床樣品的比較

按1.3的方法提取臨床樣品DNA，分別用熒光定量PCR和套式PCR對276份臨床蝦樣品(凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和紅螯螯蝦)進行檢測，比較檢測結果以檢驗熒光定量PCR的臨床實用性。

2 結果與分析

2.1 重組質粒標準品制備情況

以EHP的DNA為模板進行熒光定量PCR擴增，可獲得與預期目的片段大小一致的特異性條帶(圖1)；重組質粒pMD18-T-SSUEHP經(jīng)PCR鑒定及測序分析，所得的目的片段序列與GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因對應部分序列的同源性為100 %，說明目的基因片段正確插入pMD18-T載體，即重組質粒pMD18-T-SSUEHP構建成功。取陽性克隆菌液提取質粒，測定濃度并轉換為拷貝數(shù)，重組質粒pMD18-T-SSUEHP濃度為6.83×109拷貝/μl，OD260/OD280為1.96，滿足標準品的要求。

M：DL500 DNA Marker；1～3：EHP-SSU rDNA基因；4～5：重組質粒pMD18-T-SSUEHP；NC：陰性對照

2.2 熒光定量PCR反應體系優(yōu)化結果

分別以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl的標準品DNA為模板，上、下游引物濃度為0.1～0.8 μmol/L時的熒光定量PCR擴增結果顯示，隨著引物濃度的增大，ΔRn增大、Ct值減小，但引物終濃度在0.6～0.8 μmol/L時的擴增效果(Ct值和ΔRn)差異不明顯。圖2為以1.0×106拷貝/μl標準品DNA為模板的擴增結果。經(jīng)3次重復試驗，為保證引物的擴增效率且不浪費試驗材料，確定0.6 μmol/L為最佳引物終濃度。

圖2 熒光定量PCR的引物濃度優(yōu)化結果

分別以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl的標準品DNA為模板，TaqMan-MGB探針濃度為0.1～0.8 μmol/L時的熒光定量PCR擴增結果顯示，隨著探針濃度的增大，ΔRn增大、Ct值減小，但探針終濃度在0.5～0.8 μmol/L時的擴增效果(Ct值和ΔRn)差異不明顯。圖3為以1.0×106拷貝/μl標準品DNA為模板的擴增結果。經(jīng)3次重復試驗，為保證TaqMan-MGB探針的效率且不浪費試驗材料，確定0.6 μmol/L為最佳探針濃度。

圖3 熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結果

通過引物濃度和探針濃度優(yōu)化后，確定基于TaqMan-MGB探針的熒光定量PCR最佳反應體系：2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，上、下游引物EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各1.2 μl，TaqMan-MGB探針EHP-qP66(10 μmol/L)1.2 μl，DNA模板2.0 μl，用滅菌水補足至20.0 μl。

2.3 熒光定量PCR擴增標準曲線及其敏感性

以10倍梯度稀釋的標準品DNA(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)為模板進行熒光定量PCR擴增，結果(圖4)顯示各梯度標準品的擴增曲線重復性好、熒光強度增量明顯，高濃度標準品(1.0×109～1.0×103拷貝/μl)的擴增曲線呈典型的S形，低濃度標準品(1.0×102～1.0×100拷貝/μl)的擴增曲線因未達擴增平臺期而呈半S形，陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)任何擴增曲線。經(jīng)數(shù)據(jù)分析建立標準曲線，起始模板拷貝數(shù)為2.0×109～2.0×100拷貝/μl時，模板濃度對數(shù)與Ct值間呈良好的線性關系(圖5)，對應的線性回歸方程為y=-3.232×lg(x)+39.51，Eff.(擴增效率)和RSq(相關系數(shù)方值)分別為103.9 %和1.000。標準品DNA為20拷貝/反應時，3個重復的Ct值分別為34.81、34.88和34.91，仍有明顯的擴增曲線，且重復性好；標準品DNA為2拷貝/反應時，3個重復的Ct值分別為37.84、38.28和38.71，重復性差。因此，為保證檢測結果的準確性，建議在實際檢測工作中以Ct值35.00為臨界值，若檢測樣品的Ct值小于或等于35.00，且有擴增曲線，判為EHP陽性；Ct值大于35.00，且有擴增曲線，則重復1次，如結果一致，判為EHP陽性；Ct值大于35.00，重復結果未出現(xiàn)擴增曲線，判為EHP陰性。綜上所述，基于TaqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR檢測方法對標準品具有很高的擴增效率，標準品起始模板為2.0×109～2.0×101拷貝/反應時，建立的標準曲線能準確反映目的產物的擴增情況，可用于EHP的定量分析，其靈敏度約20拷貝/反應。

圖4 標準品DNA的熒光定量PCR擴增曲線(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)

圖5 熒光定量PCR檢測EHP的標準曲線

2.4 熒光定量PCR的特異性

采用優(yōu)化后的熒光定量PCR對蝦常見病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA進行檢測，結果顯示只有EHP出現(xiàn)擴增曲線(圖6)，Ct值分別為22.07、22.10和22.16，判為陽性；而其他病原及陰性對照、空白對照均未出現(xiàn)擴增曲線，判為陰性。說明基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR對EHP檢測具有很強的特異性。

圖6 熒光定量PCR特異性檢測結果

2.5 熒光定量PCR的重復性

以1.0×107、1.0×105和1.0×103拷貝/μl的標準品DNA在間隔第7和14天分別進行重復試驗，結果(表2)顯示，其組內的試驗變異系數(shù)(CV)為0.26 %～0.72 %，組間試驗變異系數(shù)為0.56 %～0.92 %，表明基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR重復性好，檢測結果穩(wěn)定可靠；同時說明本研究制備的重組質粒DNA穩(wěn)定性好，可作為標準品和陽性對照使用。

表2 熒光定量PCR的重復性試驗結果

2.6 熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

分別采用基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR和套式PCR對10倍梯度稀釋的EHP陽性DNA (100～10-5)進行檢測，結果顯示，熒光定量PCR可檢測到10-4稀釋度的陽性DNA(圖7)，而套式PCR可檢測到10-3稀釋度的陽性DNA(圖8)，即熒光定量PCR的敏感度較套式PCR高一個數(shù)量級(10倍)。

圖7 熒光定量PCR的敏感性檢測結果

M：DL500 DNA Marker；1～6：套式PCR第一輪PCR產物；7～12：套式PCR第二輪PCR產物；NC：陰性對照

2.7 熒光定量PCR和套式PCR檢測臨床樣品的結果比較

分別采用基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR和套式PCR對276份臨床蝦樣品進行檢測，結果(表3)顯示，有46份蝦樣品用兩種方法檢測均為陽性，Ct值為15.73～32.91，根據(jù)標準曲線方程y=-3.232×lg(x)+ 39.51計算，其EHP拷貝數(shù)在1.10×102～2.28×107拷貝/反應，蝦樣品的EHP含量為1.10×102～2.28×107拷貝/mg；有8份蝦樣品經(jīng)熒光定量PCR檢測呈陽性而經(jīng)套式PCR檢測呈陰性，Ct值為33.16～36.49，其EHP拷貝數(shù)在9.2×101～8.6×100拷貝/反應，蝦樣品的EHP含量為9.2×101～8.6×100拷貝/mg；有221份蝦樣品用兩種方法檢測均為陰性，即兩種方法的符合率為96.7 %。說明在實際檢測工作中采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進行40個循環(huán)的擴增反應，可提高EHP低拷貝數(shù)樣品的檢出率，其檢測靈敏度約10拷貝/mg。2018和2019年廣西蝦樣品的EHP陽性率分別為16.2 %(23/142)和30.6 %(41/134)，主要檢出品種為凡納濱對蝦。

表3 采用熒光定量PCR和套式PCR檢測臨床樣品EHP結果比較

3 討 論

我國于2013年首次證實在養(yǎng)殖凡納濱對蝦中存在EHP感染，并于2017年將EHPD納入國家水生動物疫病監(jiān)測計劃。近年來的監(jiān)測結果顯示，EHP陽性率一直占據(jù)對蝦疫病之首，EHP感染已蔓延至我國所有對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，包括廣東、廣西、海南、福建、山東、江蘇、浙江、天津等沿海地區(qū)及新疆等內陸地區(qū)，感染品種包括凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、中國對蝦、克氏原螯蝦和青蝦等我國主要養(yǎng)殖蝦類品種，說明EHPD在我國的流行傳播形勢十分嚴峻，已成為制約我國當前蝦類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[29]。EHP感染的苗種和養(yǎng)殖對蝦是EHPD傳播的重要風險源。因此，為避免該病原的傳播擴散和發(fā)生發(fā)展，亟需研發(fā)出一種方便快捷的檢測方法。目前，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和國內均未發(fā)布EHP檢測的相關標準，農業(yè)農村部在EHPD監(jiān)測計劃中推薦采用套式PCR進行檢測，但在實際檢測工作中套式PCR需兩輪PCR及電泳，操作繁瑣、檢測耗時長且不可定量；此外，EHP感染數(shù)量與其危害密切相關的特點需對EHP進行準確定量檢測，才能根據(jù)EHP定量數(shù)據(jù)制定相應的預防或預后措施，套式PCR顯然已無法滿足對EHP進行快速定量檢測的要求。基于TaqMan-MGB探針的熒光定量PCR既能克服套式PCR的上述缺點，又能發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)勢，尤其是TaqMan-MGB探針連接的MGB淬滅基團具有探針長度短、熒光本底小、穩(wěn)定性好及分辨率高等特點，非常適用于病原體的定量檢測[30]。

本研究鑒于EHP定量檢測的需求及TaqMan-MGB探針應用于病原體檢測的優(yōu)勢，在EHP的SSU rDNA基因保守序列設計特異性引物及TaqMan-MGB探針，制備重組質粒標準品pMD18-T-SSUEHP，并對反應體系進行優(yōu)化以確定檢測EHP的熒光定量PCR最佳條件，結果表明，重組質粒pMD18-T-SSUEHP的DNA穩(wěn)定性好，其濃度和純度均能滿足作為標準品和陽性對照的要求；建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對標準品的擴增效率高，起始模板范圍在2×101～2×109拷貝/反應時，其擴增標準曲線的線性關系良好，能準確反映目的產物的擴增情況；靈敏度高，對標準品的檢測靈敏度可達20拷貝/反應，對蝦樣品的EHP檢測靈敏度約10拷貝/mg，較套式PCR約提高10倍；特異性強，對蝦類其他常見病原均無擴增反應；重復性好，組內和組間變異系數(shù)均小于1.00 %；此外，擴增和產物分析同步完成，無需PCR后處理，整個檢測過程可在1 h內完成。采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR同時對276份臨床蝦樣品的檢測結果顯示，對于EHP拷貝數(shù)低(小于100拷貝/mg)的樣品，TaqMan-MGB探針熒光定量PCR比套式PCR具有更高的靈敏度，總陽性檢出率提高2.6 %(多檢出7份)?？梢?，基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量范圍寬及簡單快速等優(yōu)點，不僅能滿足臨床上對EHP進行快速定量檢測的需求，還能提高EHP低感染水平如早期感染或潛伏感染的陽性檢出率，對控制EHPD的傳播與擴散具有重要意義。

本研究對近年廣西養(yǎng)殖蝦類樣品的檢測結果表明，2019年EHP陽性檢出率(30.6 %)較2018年(16.2 %)約增加一倍，且養(yǎng)殖凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和紅螯螯蝦均有檢測到EHP陽性，在臨床上表現(xiàn)出生長緩慢或停滯的蝦幾乎都能檢測到EHP，說明EHPD已成為危害廣西養(yǎng)殖對蝦主要疫病之一。但由于EHP感染不直接導致蝦類死亡而易被忽視，且EHP感染數(shù)量與其危害呈正相關，因此加強蝦類養(yǎng)殖過程中EHP感染強度的實時監(jiān)測，可為制定相應的防控措施提供重要依據(jù)?；赥aqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR符合當前養(yǎng)殖生產中對EHP高靈敏定量檢測技術的需求，將在親蝦篩選、苗種檢疫、疫情監(jiān)測等各養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

4 結 論

基于TaqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量范圍寬及簡單快速等優(yōu)點，適用于蝦類樣品的EHP定量檢測，可為EHP實時監(jiān)測及EHPD快速診斷提供一種新的技術手段。