血清微小RNA-433和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在擴(kuò)張型心肌病合并慢性心力衰竭患者中的變化及臨床意義

杜春書 王軍 黃佩花 吳多省 陳夢(mèng)飛

心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是各種器質(zhì)性心血管疾病的終末期階段，血流負(fù)荷過重或由心肌梗死引起心臟重構(gòu)是心衰的主要病理生理基礎(chǔ)[1]。既往研究證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路自心肌代償性肥大至心衰發(fā)生各階段均發(fā)揮重要作用[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，微小RNA(miRNA，miR)在心衰發(fā)生、發(fā)展過程中的作用越來越受到重視[3]。Espinosa-Diez等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-433通過反饋性放大TGF-β1/Smad3-Azin1信號(hào)通路促進(jìn)腎臟纖維化。我們通過分析擴(kuò)張型心肌病(DCM)合并慢性心衰(CHF)患者血清miR-433和TGF-β1水平變化及其與心功能的相關(guān)性，旨在為miR-433和TGF-β1在心衰發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2017年8月～2019年2月于海南省東方市東方醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科確診并接受治療的DCM合并CHF患者106例(DCM合并CHF組)，其中男67例，女39例，年齡37～81歲，平均年齡(62.1±12.0)歲，紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)心功能Ⅱ級(jí)33例，Ⅲ級(jí)47例，Ⅳ級(jí)26例。同時(shí)選取100例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男60例，女40例，年齡34～80歲，平均年齡(60.3±13.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)心肌病診斷與治療建議》[5]關(guān)于DCM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[心臟擴(kuò)大：左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)>5.5cm(男性)或>5.0cm(女性)；左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%]；(2)符合歐洲心臟病學(xué)會(huì)關(guān)于CHF的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(3)NYHA心功能分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)[7]；(4)有明確的基礎(chǔ)心臟病史。排除縮窄性心肌炎、心包炎、家族性DCM、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、急慢性感染、外傷及長(zhǎng)期大量吸煙、飲酒、濫用藥物者。本研究經(jīng)海南省東方市東方醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)血清miR-433水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-433水平。抽取兩組受試者空腹肘靜脈血2 ml,加入乙二胺四乙酸抗凝，離心取上清液，采用Trizol and miRNeasy mini試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取總RNA，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)檢，若A260 nm/A280 nm為1.8～2.1，則質(zhì)檢合格。采用miScript Ⅱ RT kit(50)(德國(guó)Qiagen公司)和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(中國(guó)TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-433莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(上海生工生物工程有限公司)序列為5’-CGT GGT GAA CCT CCG TTT TAC CCG GTC TAA TGA GGA GGG CCC TAT GTC GAA TCC CCC GAT GGG -3’；miR-433擴(kuò)增上游引物為5’-GTA CGG GCA AAT AAC CCC CGA GTC GC-3 ’，下游引物為5 ’-CCT GCC GTA TGG GTA CGT GCC AT-3’，以小分子U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s共45個(gè)循環(huán)。以2表示miR-433相對(duì)表達(dá)水平。

(2)血清TGF-β1水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)兩組受試者血清TGF-β1水平，ELISA試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司。

(3)生化指標(biāo)檢測(cè)：采用Cobas e411全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏)檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、氨基末端B型鈉尿肽前體(NT-proBNP)等。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖(FPG)和餐后2 h血糖(2 h PG)。

結(jié) 果

1.兩組受試者一般資料和臨床資料比較：兩組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史及FPG、2 h PG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而DCM合并CHF組患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組受試者一般資料和臨床資料比較

2.DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平呈正相關(guān)(r=0.302，P<0.001)，見圖1。

圖1 DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平的相關(guān)性分析

3.不同NYHA心功能分級(jí)的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較：NYHA心功能Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著NYHA心功能分級(jí)的增加，其血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐漸升高，LVEF逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同NYHA心功能分級(jí)的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較

4.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平與心功能的相關(guān)性分析：Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均與NYHA心功能分級(jí)呈正相關(guān)(rs=0.576、0.473，P均<0.001)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均與NT-proBNP(r=0.455、0.410，P均<0.001)、LVEDd(r=0.388、0.372，P均<0.001)呈正相關(guān)；而血清miR-433和TGF-β1水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.420、-0.365，P均<0.001)。

5.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1與心功能分級(jí)的關(guān)系：將NYHA心功能分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ級(jí))作為因變量，賦值為1，分別將血清miR-433和TGF-β1水平以連續(xù)變量納入logistic回歸方程，未校正混雜因素時(shí)，血清miR-433和TGF-β1均是DCM合并CHF患者NYHA心功能分級(jí)進(jìn)展的影響因素(P<0.05)；校正各項(xiàng)混雜因素后，血清miR-433和TGF-β1仍是DCM合并CHF患者心功能損傷加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1與心功能分級(jí)關(guān)系的多因素logistic回歸分析

討 論

DCM以心室異常擴(kuò)張、心室壁變薄、心肌纖維化等為主要病理表現(xiàn)。根據(jù)指南推薦，DCM的治療原則為阻止或延緩心肌損傷進(jìn)程[8]，因此，亟需針對(duì)心肌纖維化和心室重構(gòu)的研究。Cho等[9]的研究結(jié)果顯示，TGF-β1可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞活化并向肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。Chen等[10]的研究結(jié)果顯示，通過抑制大鼠TGF-β1基因表達(dá)后，心臟TGF-β1水平明顯降低，進(jìn)而抑制其心室重構(gòu)，延緩心衰的發(fā)生，因此推測(cè)TGF-β1及其調(diào)控通路有望成為抗心肌纖維化治療的重要靶點(diǎn)之一。但Heldin等[11]卻發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1表達(dá)雖能抑制心肌纖維化，改善心肌細(xì)胞功能，但卻加劇了左心室擴(kuò)張和炎癥反應(yīng)，因此，TGF-β1在心衰不同的發(fā)展階段可能發(fā)揮著不同作用，針對(duì)TGF-β1的抑制劑用于心衰的治療尚存在爭(zhēng)議。

心臟中的TGF-β1主要是由心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞分泌，TGF-β1反過來又可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。既往有研究證實(shí)，在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特定的miRNA可改善或損傷心肌功能，影響心力衰竭的進(jìn)程。李軍等[12]的研究結(jié)果顯示，敲除小鼠miR-1252基因表達(dá)后，其心肌纖維化程度明顯加重，同時(shí)TGF-β1表達(dá)水平升高。而史曉婧等[13]的研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-808后，大鼠成纖維細(xì)胞TGF-β1水平明顯降低，進(jìn)而改善心肌梗死后心肌纖維化的程度。miR-433定位于12號(hào)染色體，在腫瘤領(lǐng)域中的研究較為深入。陶麗嬋等[14]通過建立DCM小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其miR-433表達(dá)水平明顯升高。Li等[15]發(fā)現(xiàn)miR-433在纖維化腎臟組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，隨后證實(shí)miR-433可能通過促進(jìn)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路激活進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433水平高于對(duì)照組，且與TGF-β1水平呈正相關(guān)。目前對(duì)于CHF的診斷和分層主要依據(jù)心臟超聲、腦鈉肽、NT-proBNP、心肌損傷標(biāo)志物等，除此以外，近幾年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些炎癥類(如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α)或代謝類(如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-7)心肌功能生物標(biāo)志物，但提供的信息均有限，尚未發(fā)現(xiàn)可反映心衰進(jìn)展和心肌纖維化程度的標(biāo)志物，因此，從miRNA水平探索新的標(biāo)志物對(duì)于臨床精準(zhǔn)治療具有重要價(jià)值。本研究中，隨著NYHA心功能分級(jí)的增加，DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐漸升高，LVEF逐漸降低，提示miR-433在DCM合并CHF的發(fā)生及病情進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，且血清miR-433與TGF-β1水平呈正相關(guān)，表明二者之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系；同時(shí)血清miR-433、TGF-β1水平均與NT-proBNP、LVEDd、LVEF密切相關(guān)，表明在DCM合并CHF患者中，miR-433也可能參與心肌纖維化和心室重構(gòu)；多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，校正各項(xiàng)混雜因素后，血清miR-433和TGF-β1均為DCM合并CHF患者心功能損傷加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于正常對(duì)照者，且均與NYHA心功能分級(jí)呈正相關(guān)，同時(shí)miR-433和TGF-β1也存在一定聯(lián)系，但其具體機(jī)制尚未明確，血清miR-433和TGF-β1是否可用于心衰的危險(xiǎn)分層、作為潛在心衰的治療靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探討。