發(fā)酵對(duì)蛋白桑1-脫氧野尻霉素提取量的影響

李 旺，韓蘊(yùn)琦，丁 軻，曹平華，趙龍妹

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023）

蛋白桑屬于桑樹屬，是由全國(guó)各地收集的28個(gè)桑樹品種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選擇與改良，雜交優(yōu)化而得的新品系 （熊意等，2016）。桑樹中有多種生物堿成分，其中1-脫氧野尻霉素（DNJ）作為一種多羥基生物堿，是降血糖的主要活性成分，具有明顯的降血糖作用 （戴開金等，2009；張旻等，2008）。DNJ能夠抑制α-糖苷酶的活性，通過(guò)降低小腸對(duì)糖類物質(zhì)的分解吸收和促進(jìn)胰島素分泌，從而達(dá)到降低血糖的作用，是一種治療糖尿病的有效藥物（Zhang 等，2014；沈小月等，2014；胡競(jìng)一等，2006）。此外，還具有抗病毒（彭忠田等，2007）、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移 （Lim等，2013）、降血壓 （Yang等，2012）、降血脂（Kim 等，2011）等功效，具有很高的食用和藥用價(jià)值。

目前，桑葉中DNJ含量的測(cè)定多采用高效液相色譜法，本試驗(yàn)采用高效液相色譜熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度好、準(zhǔn)確度高、衍生化反應(yīng)速度快、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)（歐陽(yáng)臻等，2005）。DNJ的提取量受多種因素影響，本試驗(yàn)旨在通過(guò)探討不同發(fā)酵方式和提取方法對(duì)DNJ提取量的影響，為提高DNJ的提取量和蛋白桑資源的利用率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑種植基地。菌種：產(chǎn)朊假絲酵母（Candida.utilis，CICC 32211）、枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis，LN）均為河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室保存，使用前活化。DNJ標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），F(xiàn)MOC-Cl（上海譜振生物科技有限公司），乙腈（默克公司），其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。高效液相色譜儀熒光檢測(cè)器（美國(guó)waters公司），臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) （美國(guó)Thermo Fisher公司），電熱恒溫水浴箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液制備 酵母菌活化：用接種環(huán)從實(shí)驗(yàn)室斜面培養(yǎng)基上挑取一個(gè)釀酒酵母的單菌落，置于裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按照2%的體積比接種到裝液量20%的三角瓶液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)12 h左右，至活菌數(shù)1×109cfu/mL，收集發(fā)酵液備用。

枯草芽孢桿菌活化：用接種環(huán)從實(shí)驗(yàn)室斜面培養(yǎng)基上挑取一個(gè)枯草芽孢桿菌的單菌落，置于裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按照2%的比例接種到裝液量20%的三角瓶液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)12 h，至活菌數(shù)5×109cfu/mL，收集發(fā)酵液備用。

1.2.2 發(fā)酵樣品制備 以酵母和枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，體積比1：1。準(zhǔn)確稱取50.00 g自然曬干蛋白桑粉9份，分別放置于500 mL錐形瓶中，按照料液比1：1，加蒸餾水，攪拌均勻，在121℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，按照表1設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)接種，在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，在烘箱中60℃烘干，測(cè)定枯草芽孢桿菌活菌數(shù)（每個(gè)樣品測(cè)定3次），作為發(fā)酵效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，用于篩選最佳發(fā)酵方案。按照最佳發(fā)酵方案發(fā)酵苜蓿作為DNJ提取試驗(yàn)的陰性對(duì)照，驗(yàn)證DNJ與發(fā)酵菌種是否相關(guān)。

1.2.3 DNJ的提取 按照1.2.2方法制備的樣品均采用鹽酸提取法、水提取法和乙醇提取法三種方法進(jìn)行提取。

鹽酸提取法：準(zhǔn)確稱取0.2 g蛋白桑粉放置于5 mL離心管，加入0.05 mol/L鹽酸溶液3 mL，渦旋提取 30 s，10000 r/min高速離心 15 min，取上清液，殘?jiān)偌尤?.05 mol/L鹽酸溶液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，加蒸餾水定容至50 mL，備用。

水提取法：準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白桑粉放置于50 mL離心管，加入適量超純水，80℃水浴浸提2次，每次2 h，高速離心后取上清液，合并兩次提取液，加超純水定容至100 mL，備用。

乙醇提取法：準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白桑粉放置于圓底燒瓶，加入一定量的70%乙醇，加熱回流提取2次，每次2 h，合并兩次濾液定容至100 mL，備用。

1.2.4 DNJ含量測(cè)定 參考?xì)W陽(yáng)臻（2004）的方法進(jìn)行測(cè)定。DNJ的衍生化：取提取液10μL置于1.5 mL離心管，加入10μL硼酸鹽緩沖液（pH=8.5）混合，在加入5 mmol/L的FMOC-Cl乙腈混合液20 μL，均勻混合后于20℃水浴條件下反應(yīng)20 min，然后加入0.1 mol/L甘氨酸10μL與剩余的衍生化試劑反應(yīng)，終止反應(yīng)。最后，加入0.1%的醋酸水溶液950μL稀釋，混合均勻后用0.45μm一次性無(wú)菌針頭過(guò)濾器過(guò)濾，取10μL進(jìn)行進(jìn)樣分析。

高效液相色譜條件：色譜柱：C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%醋酸-乙腈（45：55，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254 nm，發(fā)射波長(zhǎng)322 nm，進(jìn)樣量10μL。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取3.4 mg的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品定容于100 mL蒸餾水中，制得標(biāo)準(zhǔn)品母液，吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成不同濃度的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行衍生化和液相色譜分析，結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行記錄和收集，用SPSS 22進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉發(fā)酵樣品的篩選 由表1可知，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各個(gè)發(fā)酵方案，不同的發(fā)酵條件對(duì)樣品活菌數(shù)的影響比較明顯。通過(guò)計(jì)算極差分析表明，各試驗(yàn)因素對(duì)發(fā)酵桑葉總菌數(shù)的影響順序?yàn)椋簻囟龋窘臃N量＞時(shí)間，溫度對(duì)發(fā)酵的影響最大，其次是接種量，而時(shí)間在48～96 h內(nèi)，對(duì)發(fā)酵效果影響最小。進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析表明，由于因素交互作用的干擾，溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間因素之間的差異均不顯著 （P＞0.05）（表2）。通過(guò)多重比較進(jìn)行各因素組內(nèi)的差異分析，不同接種量和發(fā)酵時(shí)間組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），不同發(fā)酵溫度組內(nèi)35℃的結(jié)果顯著高于30℃和40℃（P＜0.05），說(shuō)明溫度是影響發(fā)酵效果的主要因素，接種量和發(fā)酵時(shí)間影響較小。

表1 發(fā)酵方案正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 活菌總數(shù)主效應(yīng)檢驗(yàn)

故本試驗(yàn)后續(xù)樣品根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以6%的接種量在35℃分別培養(yǎng)48、72、96 h時(shí)取樣，分別命名樣品1、樣品2和樣品3，進(jìn)行野尻霉素提取和測(cè)定試驗(yàn)。

2.2 發(fā)酵對(duì)鹽酸提取法DNJ提取量的影響 由表3可知，鹽酸提取法在不同發(fā)酵條件下DNJ提取量由高到低為：發(fā)酵樣品3＞發(fā)酵樣品2＞發(fā)酵樣品1＞空白對(duì)照＞陰性對(duì)照。發(fā)酵樣品3的DNJ提取量最高，為（1.44±0.03）mg/g，比空白對(duì)照組高13.39%，顯著高于其他樣品的DNJ提取量 （P＜0.05）。 對(duì)照組的 DNJ提取量最低，為（1.27±0.06）mg/g，顯著低于各組發(fā)酵樣品DNJ提取量 （P＜0.05）。發(fā)酵樣品1和發(fā)酵樣品2的DNJ提取量差異不顯著（P＞ 0.05）。

2.3 發(fā)酵對(duì)水提取法DNJ提取量的影響 由表3可知，水提取法在不同發(fā)酵條件下DNJ提取量由高到低為：發(fā)酵樣品3＞發(fā)酵樣品2＞發(fā)酵樣品1＞空白對(duì)照＞陰性對(duì)照。發(fā)酵樣品3的DNJ提取量最高，為（1.35±0.06）mg/g，比對(duì)照組高 51.69%，顯著高于其他樣品的DNJ提取量（P＜0.05）。對(duì)照組的 DNJ提取量最低，為（0.89±0.07）mg/g，顯著低于發(fā)酵樣品DNJ提取量（P＜0.05）。而且，不同條件下的DNJ提取量均有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 發(fā)酵對(duì)乙醇提取法DNJ提取量的影響 由表3可知，乙醇提取法在不同發(fā)酵條件下DNJ提取量由高到低為：發(fā)酵樣品3＞發(fā)酵樣品2＞發(fā)酵樣品1＞空白對(duì)照＞陰性對(duì)照。發(fā)酵樣品3的DNJ提取量最高，為（1.58±0.03）mg/g，提取量比對(duì)照組高17.03%，顯著高于其他樣品的DNJ提取量（P＜0.05）。對(duì)照組的DNJ提取量最低，為（1.35±0.07）mg/g， 與發(fā)酵樣品 1 的 DNJ提取量差異不顯著 （P＞0.05）。2.2～2.4結(jié)果說(shuō)明，DNJ的提取量跟發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，微生物和酶作用的時(shí)間長(zhǎng)，能夠使DNJ更多的溶出，有利于提取，三種提取方法均是樣品3（發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)）的樣品提取量最高。陰性對(duì)照采用相同發(fā)酵菌種和溫度，發(fā)酵96 h，但結(jié)果并無(wú)明顯的DNJ含量。說(shuō)明，DNJ來(lái)源于蛋白桑，而與發(fā)酵菌種無(wú)直接關(guān)系。

2.5 提取方法對(duì)發(fā)酵樣品DNJ提取量的影響由表3可知，對(duì)4個(gè)樣品的提取均是醇提法效果最佳。對(duì)未經(jīng)發(fā)酵處理的桑葉樣品（對(duì)照）和發(fā)酵樣品1乙醇提取法的提取效果最好，鹽酸提取法的提取效果次之，水提取法的提取效果最差。醇提法和酸提法提取的DNJ含量顯著高于水提法，但醇提取法和酸提取法的DNJ提取量差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵樣品2和發(fā)酵樣品3用三種提取方法的DNJ提取量均差異顯著（P＜0.05）。醇提法最好，水提法最差。說(shuō)明，醇作為有機(jī)溶劑更適合做小分子有機(jī)物DNJ的提取劑。

表3 提取方法對(duì)不同發(fā)酵樣品DNJ提取量的影響mg/g

2.6 方法學(xué)考察結(jié)果

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性 按照1.2.4的方法和色譜條件得到DNJ標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品的DNJ色譜圖，結(jié)果見圖1。表明各成分分離良好。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，得到回歸方程Y=2584067X+743351，R2=0.9993，表明在0.34～17μg/mL具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

2.6.2 回收率和精密度 對(duì)發(fā)酵前蛋白桑中的DNJ進(jìn)行加標(biāo)處理，回收率試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4可知，樣品平均回收率為98.6%，RSD為1.87%，說(shuō)明回收率和精密度良好。

3 討論與結(jié)論

表4 桑葉的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

3.1 DNJ的提取方法 DNJ提取的方法很多，常用的有水提取法、鹽酸提取法、乙醇提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等。曾銳等（2009）用水煎煮提取不同品種桑的不同部位，在不同桑粉中的DNJ含量差異較大，驗(yàn)證了方法的可靠性。劉凡等（2012）用0.05 mol/L的鹽酸溶液對(duì)不同桑樹品種桑葉DNJ進(jìn)行提取，獲得了較高的提取量。劉偉鋆等（2009）用70%的乙醇提取桑葉中的DNJ，提取液經(jīng)過(guò)純化后，得到DNJ含量為23.2%。胡瑞君等（2007）在提取桑葉中的DNJ時(shí)，以微波處理作為輔助條件，優(yōu)化了微波處理工藝，提高了提取量。鄭曉靜等（2012）在提取桑葉中的DNJ時(shí)，以超聲波處理作為輔助條件，優(yōu)化了超聲波提取條件，提高了DNJ的提取量。說(shuō)明不同的提取方法均具有一定的可行性，但結(jié)果存在差異，若通過(guò)不同的預(yù)處理方式，則可以對(duì)DNJ提取產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)分別選用了水提取法、鹽酸提取法和乙醇提取法三種方法提取蛋白桑樣品中的DNJ，并對(duì)相同樣品中DNJ的提取量進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量明顯高于水提取法，這是因?yàn)镈NJ是一種分子量很小的生物堿類化合物，易溶于酸性溶液，而乙醇對(duì)植物細(xì)胞有較強(qiáng)的穿透力，這都有利于對(duì)DNJ的提取。

3.2 發(fā)酵對(duì)DNJ含量的影響 DNJ的提取量除了受提取方法影響外，預(yù)處理方式對(duì)其影響也較大。發(fā)酵作為一種對(duì)桑葉的處理方式也能夠影響桑葉中DNJ的提取量。肖洪等（2013a、2013b）用混合霉菌對(duì)桑葉進(jìn)行發(fā)酵，探討了不同菌種比例及不同發(fā)酵條件（發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度）對(duì)發(fā)酵桑葉茶中的多糖、多酚和DNJ含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的菌種比例和不同的發(fā)酵條件下桑葉茶中的DNJ含量均存在差異。楊清等（2010）探討不同發(fā)酵條件對(duì)桑紅茶中生物活性成分含量的影響發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，游離氨基酸和DNJ含量逐漸增加。孫國(guó)霞等（2011）研究了黑曲霉在不同發(fā)酵溫度對(duì)桑紅茶中生物活性成分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵溫度下桑紅茶中的DNJ含量有所差異，最佳發(fā)酵溫度為32℃。最優(yōu)的發(fā)酵方案有利于主要發(fā)酵菌種的增殖和代謝，菌數(shù)的增加和代謝產(chǎn)物的分解作用是桑葉活性成分溶出的主要原因?，F(xiàn)有的發(fā)酵方案，多是人的保健品上的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，發(fā)酵菌種也多是真菌中的霉菌 （孫國(guó)霞等，2011；楊清等，2010）。本試驗(yàn)以酵母菌和芽孢桿菌的混合菌液對(duì)蛋白桑進(jìn)行發(fā)酵，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有利于發(fā)酵菌種增殖和代謝，破壞了桑葉的細(xì)胞壁，增加了發(fā)酵桑葉中的酸、酚、醇、酯等小分子物質(zhì)含量（鄒凡華和劉松青，2018；陸春霞等，2018），使 DNJ更容易溶出，通過(guò)發(fā)酵DNJ的提取量均得到了提高，豐富了蛋白桑的發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵菌種選擇。