HPLC-MS/MS 法測(cè)定煙葉中 9 種 B 族維生素

劉萍萍，申娟娟，盧紫舒，李澤鋒，張 慧，徐國云，王 晨，金立鋒，曹培健，周會(huì)娜，陳千思*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2. 鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100 號(hào) 450001

植物是自然界中水溶性B 族維生素的主要制造者，但是人們對(duì)于植物體內(nèi)B 族維生素的研究起步較晚。B 族維生素可以刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育。煙草作為一種模式植物，其體內(nèi)B 族維生素的含量和代謝特征均對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育有較大影響［1-4］。準(zhǔn)確檢測(cè)植物體內(nèi)B 族維生素的含量對(duì)了解其代謝途徑和生理機(jī)制具有重要意義［5］。建立煙葉中B族維生素的高通量和高靈敏度檢測(cè)方法有助于研究B族維生素對(duì)煙草植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

國際上常用的B 族維生素檢測(cè)方法主要是微生物法［6］，該方法只能測(cè)定其中的某一組分且實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣，樣品用量較多［7］。由于B 族維生素種類較多，因此使用微生物法無法實(shí)現(xiàn)多種B族維生素的同時(shí)分離和測(cè)定。近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞多種B 族維生素的同時(shí)測(cè)定進(jìn)行了大量研究，建立的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［8-9］、薄層色譜分析法（TLC）［10］、差分脈沖伏安法（DPV）［11］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［12-13］等。其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有分辨率高、快速簡(jiǎn)便以及多組分同時(shí)分析等特點(diǎn)，適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品的研究與分析［14-15］，逐漸成為B 族維生素的主要檢測(cè)方法。目前，基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的煙草樣品中B 族維生素的檢測(cè)方法鮮見報(bào)道，因此，建立同時(shí)測(cè)定煙葉中9 種B族維生素的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法，旨在為煙草中B 族維生素的準(zhǔn)確測(cè)定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

河南襄城縣、貴州貴陽市、湖南郴州市鮮煙葉樣品均采自當(dāng)?shù)刂髟云贩N，采集成熟期第10 葉位新鮮煙葉，樣品采集后迅速用液氮速凍，用干冰運(yùn)輸，在-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；鹽酸（AR，天津博迪化工有限公司）；甲酸（質(zhì)譜純）、甲酸銨（質(zhì)譜純）、VB1（99%）、VB2（98%）、VB3（99.5%）、VB5（98%）、VB6（98%）、VB7（99%）、VB9（標(biāo) 準(zhǔn)品）、VB12（標(biāo)準(zhǔn)品）、VB16（99%）（美國 Sigma 公司）。

1260-6490 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（美國Agilent 公司）；Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）（美國Waters公司）；PP020XXM1 超純水儀（英國Veolia 公司）；KQ-700DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；J-26XP 高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）；WondaDisc 針式過濾器（0.45 μm 濾膜，日本Shimadzu 公司）；pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠）；高通量組織研磨儀（德國Retsch 公司）。

1.2 樣品處理與分析

用液氮速凍新鮮煙葉（河南襄城縣，成熟中部葉，品種K326），冷凍干燥后用粉碎機(jī)打碎成粉末備用。取20 mg 冷凍保存的煙葉樣品，加入1 mL提取劑（0.50 mmol/L 鹽酸），迅速放入超聲儀中避光超聲40 min。將樣品在4 ℃，20 000 r/min 下離心10 min，取上清液用0.45 μm 濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析。所有操作都要避光低溫，以減少B 族維生素的降解。

分別準(zhǔn)確稱取9 種B 族維生素標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用超純水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液須現(xiàn)配現(xiàn)用，其質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。

HPLC-MS/MS 分析條件為：

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L 甲酸銨水溶液（pH=5）（A 相）和0.1%甲酸-甲醇溶液（B相）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。洗脫梯度：0 ～ 2.5 min，B 相由 0 升至 10.00%；2.5～ 5.0 min，B 相升至 10.50%；5.0 ～ 7.0 min，B 相升至10.90%；7.0 ～7.1 min，B 相升至 30.33%；7.1～ 10.1 min，B 相升至 30.50%；10.1 ～ 15.0 min，B 相升至31.00%；15.0 ～ 15.1 min，B 相升至100.00%；15.1 ～ 18.0 min，B 相保持在100.00%。

電離方式：電噴霧電離源，正離子電離模式；毛細(xì)管電壓：4 kV；霧化氣壓力：275.79 kPa（40 psi）；干燥氣流量：12 L/min；干燥氣溫度：290 ℃；鞘氣流量：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。9 種B 族維生素的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

對(duì)9 種B 族維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了MS 分析，9 種B 族維生素在正離子（ESI+）的模式下響應(yīng)強(qiáng)度較高。其中，VB2、VB3、VB7、VB9、VB16主要產(chǎn)生［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰，其m/z分別為377.21、124.10、245.01、442.21、104.11；VB1在電噴霧電離時(shí)失去2 個(gè)鹽酸分子，得到［M-2HCl+H］+準(zhǔn)分子離子峰，其m/z為265.01；VB5又名D-泛酸半鈣鹽，由分子式可知，其在ESI+條件下電離時(shí)，先失去鈣離子，然后斷裂成2 個(gè)泛酸分子，形成［219+H］+準(zhǔn)分子離子峰［16］，其m/z為 220.00；VB6則失去 1 個(gè)鹽酸分子，產(chǎn)生［M-HCl+H］+準(zhǔn)分子離子峰［17］，其m/z為170.11；VB12斷裂成2 個(gè)分子，得到［M/2+H］+準(zhǔn)分子離子峰，其m/z為678.81。

表1 B 族維生素的HPLC-MS/MS 分析的保留時(shí)間、定量離子對(duì)及碰撞能量Tab.1 Retention times, quantitative ion pairs and collision energies of B vitamins by HPLC-MS/MS

將9 種B 族維生素母離子的碎片離子（子離子）進(jìn)行掃描，得到9 組信號(hào)較好，雜質(zhì)干擾較小，重現(xiàn)性較高的離子對(duì)，分別是265.01/122.10、377.21/242.80、124.10/80.00、220.00/90.00、170.11/152.10、245.01/227.00、442.21/294.90、678.81/147.20、104.11/57.90。將這些離子對(duì)作為定量離子對(duì)，用于樣品中9 種B 族維生素的定量分析。圖1 為9 種B 族維生素質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子提取色譜圖。

2.1.2 流動(dòng)相pH 的確定

圖1 9 種B 族維生素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 9 B vitamins

分別配制 pH=2、3、4、5、6 的甲酸銨水溶液作為流動(dòng)相，考察不同pH 甲酸銨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)9 種B 族維生素的離子化效果。以l gS（S為目標(biāo)物色譜峰面積）作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，在各pH 下測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。由圖 2 可知，VB2、VB5、VB7、VB9、VB12在 pH=5 時(shí)信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度最高，其他 4 種B 族維生素在pH=6 時(shí)信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度最高。由于植物體內(nèi)VB9和VB12的含量較低，且信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度較弱，因此優(yōu)先考慮這2 種B 族維生素信號(hào)響應(yīng)值較高時(shí)對(duì)應(yīng)的pH。經(jīng)過綜合分析，選擇pH=5的甲酸銨水溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 柱溫的確定

柱溫會(huì)影響目標(biāo)物的分離效果，因此考察了柱溫對(duì)B 族維生素響應(yīng)值的影響。結(jié)果（圖3）表明，在40 ℃時(shí)，B2、B6、B7、B9、B12的響應(yīng)值最高，而B1和B16受柱溫的影響較小。因此確定柱溫為40 ℃。

圖2 不同流動(dòng)相pH 對(duì)9 種B 族維生素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of mobile phase pH on response intensity of 9 B vitamins

圖3 不同柱溫對(duì)9 種B 族維生素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of column temperature on response intensity of 9 B vitamins

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取劑濃度

煙葉中的成分非常復(fù)雜，樣品在電噴霧離子源中電離時(shí)，存在離子增強(qiáng)和離子抑制效應(yīng)，并且大部分B 族維生素在弱酸性環(huán)境條件下較穩(wěn)定，在pH＜2.0 時(shí)則會(huì)發(fā)生降解［18］。因此，需要選擇合適的提取劑，確保B 族維生素盡可能少地被破壞，以獲得較高的響應(yīng)信號(hào)，便于定量分析。根據(jù)B 族維生素的特性和相似相溶原理［19］，選擇稀鹽酸溶液作為提取劑，并對(duì)鹽酸濃度進(jìn)行了考察。比較了0、0.05、0.50、1.50、5.00、15.00、50.00 mmol/L鹽酸溶液作為提取劑時(shí)的提取效果，結(jié)果（圖4）顯示，不同鹽酸溶液濃度對(duì)B 族維生素的信號(hào)相應(yīng)值有明顯的影響，當(dāng)鹽酸溶液濃度為0.50 mmol/L時(shí)，VB1、VB2、VB6、VB7、VB12和VB16的響應(yīng)值達(dá)到最高。因此，選擇0.50 mmol/L 鹽酸溶液作為提取劑。

圖4 不同提取劑鹽酸濃度對(duì)9 種B 族維生素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of HCl concentration in extraction solvent on response intensity of 9 B vitamins

2.2.2 提取劑體積

在考慮樣品提取劑中鹽酸濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究樣品提取劑體積對(duì)提取效率的影響。取20 mg 煙葉樣品，分別用0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mL提取劑按照1.2 節(jié)方法對(duì)B 族維生素進(jìn)行提取和分析。結(jié)果（圖5）顯示，提取劑體積對(duì)9 種B 族維生素檢測(cè)結(jié)果有一定影響，其中 VB3、VB6、VB7、VB9和VB12在提取劑體積為1 mL 時(shí)響應(yīng)值最高，VB1、VB2和VB16的響應(yīng)值幾乎不受提取劑體積變化的影響。綜合考慮，選擇提取劑體積為1 mL。

圖5 不同提取劑體積對(duì)9 種B 族維生素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of extraction solvent volume on response intensity of 9 B vitamins

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

用9 種B 族維生素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制不同濃度的混合標(biāo)樣系列工作溶液，按照1.2 節(jié)方法進(jìn)樣檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3 次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），目標(biāo)組分定量離子的峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。采用稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測(cè)定9 種B 族維生素，以3 倍信噪比確定檢出限。9 種B 族維生素的線性方程、決定系數(shù)（R2）及檢出限見表 2。可以看出，9 種 B 族維生素在線性范圍內(nèi)的決定系數(shù)R2為0.994 6 ～0.999 9。VB12的檢出限最低，為 0.01 ng/mL；VB1的檢出限最高，為0.50 ng/mL；其余B 族維生素的檢出限在0.02 ～0.40 ng/mL 之間。可見，本方法線性較好，靈敏度較高。

表2 9 種B 族維生素的線性方程、決定系數(shù)和檢出限Tab.2 Linear equation, determination coefficient（R2）and limits of detection（LODs）of 9 B vitamins

將煙草樣品按照1.2 節(jié)方法進(jìn)行處理和檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定3 d，每天測(cè)定5 次，以考察方法的精密度。結(jié)果（表3）顯示，RSD 均小于10%，說明方法的精密度和穩(wěn)定性較好。

表3 9 種B 族維生素測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)和日間精密度Tab.3 Intra-and inter-day precisions of analytical results of 9 B vitamins (%)

2.3.2 回收率

由文獻(xiàn)［20］可知，基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)定方法主要有兩種，本研究中采用的是提取后添加法，同時(shí)考察了提取回收率。對(duì)已知B 族維生素濃度的煙草樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定目標(biāo)物在高、中、低3 個(gè)水平下的回收率，每個(gè)水平重復(fù)5 次。由表4 可知，9 種 B 族維生素的平均回收率在 91.00% ～108.79%之間，RSD 為0.34% ～ 5.04%，說明本方法較可靠。

2.4 煙葉樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)河南襄城縣、貴州貴陽市、湖南郴州市3 個(gè)產(chǎn)區(qū)成熟期第10 葉位烤前鮮煙葉進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表5?？梢钥闯?，不同產(chǎn)區(qū)間煙葉中B 族維生素含量有一定差異，相較于其他產(chǎn)區(qū)，河南襄城縣產(chǎn)區(qū)煙葉中VB2、VB7、VB9含量較高，貴州貴陽市產(chǎn)區(qū)煙葉中VB3含量較高。

表4 9 種B 族維生素的加標(biāo)回收率和RSD（n=5）Tab.4 Spiked recoveries and RSDs of 9 B vitamins（n=5）

表4（續(xù)）

表5 3 個(gè)煙葉樣品中9 種B 族維生素的檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Test results of 9 B vitamins in 3 tobacco leaf samples (μg·g-1)

3 結(jié)論

建立了鮮煙葉中 9 種 B 族維生素（VB1、VB2、VB3、VB5、VB6、VB7、VB2、VB12和 VB16） 的HPLC-MS/MS 分析方法。本方法的回收率為91.00% ～108.79%，日內(nèi)和日間精密度（RSD）為1.25% ～ 9.73%，9 種 B 族維生素的檢出限為 0.01 ～0.50 ng/mL。利用建立的方法對(duì)3 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)煙葉中9 種B 族維生素化合物進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)間煙葉中B 族維生素含量有一定差異，相較于其他產(chǎn)區(qū)，河南襄城縣產(chǎn)區(qū)煙葉中VB2、VB7、VB9的含量較高，貴州貴陽市產(chǎn)區(qū)煙葉中VB3含量較高。本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，適用于煙葉中多種B 族維生素的同時(shí)分析。