基于UPLC-QTOF-MS技術(shù)對廬山云霧茶成分分析及真?zhèn)闻袆e

劉 曄 王遠(yuǎn)興

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

廬山云霧茶因產(chǎn)自江西省九江市的廬山而得名，是中國十大名茶之一。廬山?jīng)鏊囔F的氣候使茶葉葉厚毫多，正是因獨(dú)特的氣候條件而造就了廬山云霧茶。廬山云霧茶含有較多的單寧、芳香油類和維生素，味道濃郁清香，怡神解瀉，助消化，殺菌解毒。因茶葉中含有大量的茶多酚，故是抗氧化活性的天然化合物，多被應(yīng)用于保健品和功能性食品中。

近年來，對廬山云霧茶的研究越來越多。廬山云霧茶產(chǎn)地的鑒別，如利用高光譜圖像技術(shù)[1]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[2]。廬山云霧茶的營養(yǎng)成分的提取研究，如茶籽油脂肪酸[3]、茶多糖[4]、茶多酚的提取[5]。目前，多種現(xiàn)代分析技術(shù)（核磁共振、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用）應(yīng)用于茶葉的分析，其中液-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是復(fù)雜樣品中化學(xué)組成分析和鑒定的重要分析工具，特別是具有高分辨率、高靈敏度的UPLC-QTOF-MS，它能夠在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下對茶葉中微量成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并做初步鑒定[6]。Agilent Mass Profiler Professional 代謝組學(xué)軟件（簡稱MPP 軟件）經(jīng)常被用于歸屬真?zhèn)舞b別、產(chǎn)品質(zhì)量鑒定及工藝流程監(jiān)控。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相質(zhì)譜聯(lián)用、核磁等手段對樣品進(jìn)行分離檢測，采用安捷倫分析軟件進(jìn)行特征提取定量，最終用MPP 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

目前，對廬山云霧茶詳細(xì)的抗氧化活性成分及分離鑒定研究較少。本試驗(yàn)利用UPLC-QTOFMS 技術(shù)對廬山云霧茶醇提物進(jìn)行定性分析，結(jié)合文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫初步鑒定，利用MPP 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（構(gòu)建PLS-DA 模型）。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

供試廬山云霧茶來源于通遠(yuǎn)鎮(zhèn)（S1-S5），廬山茶科所茶場；賽陽鎮(zhèn)，廬山露語茶業(yè)有限公司；星子縣，星子縣廬山七尖云霧茶有限公司，廬山市本地、市面上采買的測試茶葉樣本。供試品均采于2016年5月份，樣品放置于4 ℃冰箱中保存。

甲醇（色譜純級），德國Merck 公司；甲酸（色譜純級），ROE 公司；水，屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290 超高相液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測器）、Eclipse Plus-C 18 column （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、Aglient6538 高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國Agilent 公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，機(jī)械昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取茶葉粉末1.00 g 于50 mL 的離心管中，加入15 mL 甲醇溶液（70%），超聲波提取1 h，離心4 800 r/min，10 min。重復(fù)提取上清液3 次，合并定容至50 mL。提取液放在4 ℃冰箱備用。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：流動(dòng)相：以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A 和乙腈為流動(dòng)相B 進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫：0～15 min：5%～20%（B）；15～25 min：20%～45%（B）。二級管陣列檢測器（DAD） 波長：210，230，254，278，360 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式；電噴霧離子源（ESI）；離子范圍：m/z 100～1 500；碰撞氣：氮?dú)猓幻?xì)管電壓：3.5 kV；碰撞電壓：175 V；碰撞能：10～50 V；干燥氣流速：10.0 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；霧化氣壓力：30 psi。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用安捷倫定性分析軟件對化合物的母離子、碎片離子等信息進(jìn)行分析。將分析得到的代謝指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP 12.1 分析軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，構(gòu)建PLS-DA 模型對廬山云霧茶真?zhèn)闻袆e。

2 結(jié)果與分析

2.1 廬山云霧茶醇提成分初步鑒定

廬山云霧茶提取液經(jīng)UPLC-QTOF-MS 測定，在定性軟件中根據(jù)提取液中化合物的保留時(shí)間、母離子、碎片離子等信息，利用數(shù)據(jù)庫和相關(guān)類型文獻(xiàn)對化合物做初步判斷。鑒定結(jié)果見表1，總離子流圖如圖1所示。初步鑒定出93 種化合物，包括黃酮類：2 種異黃酮：染料木苷和染料木苷-5-O-糖苷。28 種黃酮醇：槲皮素-7-O-己糖苷，山奈酚，圣草素-O-己糖苷I，山奈酚-3-鼠李糖苷，二氫槲皮素-鼠李糖苷，山奈酚7-O-B-D-葡萄糖苷，夏佛塔苷，楊梅素蘆丁糖苷，楊梅素己糖苷，紫云英苷，牡荊素-2″-O-糖苷，紫杉葉素己糖苷，槲皮素-3-O-糖苷酸，山奈酚二己糖苷，牡荊素，異牡荊素，蘆丁，金絲桃苷，異槲皮素，刺槐素，異葒草素-2″-O-鼠李糖苷，異葒草素，葒草素-2″-O-鼠李糖苷，葒草素，柚皮素-4′-O-葡萄糖苷，槲皮素，大波斯菊苷。16 種黃烷醇：兒茶素吡喃葡萄糖苷，GC，EGC，C，EGCG，EC，GCG，ECG，CG，原花青素B2，原花青素B1等。5 種黃烷酮：柚皮素-8-Cβ-D-葡萄糖苷，柚皮素-6-C-β-D-葡萄糖苷，櫻桃苷，柚皮素和柚皮素-4′-O-葡萄糖苷。11 種有機(jī)酸：葡萄糖酸，奎尼酸，草酸，異檸檬酸，富馬酸，蘋果酸，檸檬酸，檸蘋酸，琥珀酸，羥甲基戊二酸和異丙基蘋果酸。4 種氨基酸：茶氨酸，焦谷氨酸，亮氨酸和苯基丙氨酸。其余27 種化合物為酚酸。

2.1.1 黃酮類

1） 異黃酮 峰73 和峰75 的母離子[M－H]－m/z 431 分子式為C21H20O10，特征碎片離子均有m/z 477[M－H+HCOOH]－，m/z 269[M－H－C6H10O5]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10]判斷其出峰順序，化合物73 和75 分別為染料木苷及染料木苷-5-O-糖苷。

圖1 廬山云霧茶70%甲醇提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Lu Mountain Clouds-Mist tea in 70% methanol extracts

表1 廬山云霧茶70%甲醇提取物中鑒定的化合物Table 1 The chemical profiling in 70% methanol extract of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2） 黃酮醇 峰17、峰81 和峰82 的母離子[M－H]－m/z 463.0854 分子式為C21H20O12，特征碎片離子分別為m/z 301.0316 [M－H－C6H10O5]－，300.05[M－H－C6H11O5]－，271.0519[M－H－C7H12O6]－，179.0368 [M－H－C6H10O5－C7H6O2]－和151.0369 [MH－C6H10O5－C8H6O3]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10-11，16]推斷出峰順序，化合物17 可能是槲皮素-7-O-己糖苷，化合物81 可能是金絲桃苷，化合物82 可能是異槲皮素。峰51 的母離子[M－H]－m/z 593.1489 分子式為C27H30O15，特征碎片離子為m/z 285.0366[M－H－鼠李糖]－，根據(jù)文獻(xiàn)[11]，化合物51 可能是山奈酚-3-鼠李糖苷。峰58、峰64、峰85 和峰87 的母離子[M－H]－m/z 447 分子式為C21H20O11，峰58，峰64 特征碎片離子為m/z 285[M－H－C6H10O5]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10]，化合物58 可能是山奈酚7-O-B-D-葡萄糖苷，化合物64 可能是紫云英苷，峰85 和峰87 根據(jù)文獻(xiàn)[19]，初步斷定出峰順序，化合物85 可能是異葒草素，化合物87 可能是葒草素。峰69 的母離子[M－H]－m/z 465.1017 分子式為C21H22O12，特征碎片離子為m/z 303.4659[M－H－C6H10O5]－，259.05[MH－CO2－C6H10O5]－和241.1879[M－H－C8H13O7]－，根據(jù)文獻(xiàn)[13]，化合物69 可能是紫杉葉素己糖苷。峰72、峰74 和峰93 的母離子[M－H]－m/z 431 分子式為C21H20O10，特征碎片離子均有m/z 269 [M－HC6H10O5]－，m/z 281[M－H－C5H9O5]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9，19]判斷其出峰順序，化合物72 和74 分別為牡荊素及異牡荊素。根據(jù)文獻(xiàn)[16]判斷峰93 可能是大波斯菊苷。峰77 的母離子[M－H]－m/z 609.1414 分子式為C27H30O16，特征碎片離子為m/z 301.0198[M－H－蘆丁]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物77 可能是蘆丁。峰83 的母離子[M－H]－m/z 739.2094 分子式為C33H40O19，特征碎片離子為m/z 593.1496[M－H－鼠李糖]－和285.0407[M－H－鼠李糖－刺槐糖]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物83 可能是刺槐素。峰92 的母離子[M－H]－m/z 301.0345 分子式為C15H10O7，特征碎片離子為m/z 273.0413[M－H－CO]－，257.8181[MH－CO2]－，229.8729[M－H－CO－CO2]－和179.8531[MH－C7H6O2]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物92 可能是槲皮素。

3） 黃烷醇 峰24 的母離子 [M－H]－m/z 451.1221 分子式為C21H24O11，特征碎片離子為m/z 289.0729[M－H－吡喃葡萄糖]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物24 可能是兒茶素吡喃葡萄糖苷。峰29、峰33、峰38 和峰41 的母離子[M－H]－m/z 為577 分子式為C30H26O12，特征碎片離子都為m/z 451 [M－HC6H6O3]－，425[M－H－C8H8O3]－，407[M－H－C8H10O4]－，289[M－H－C15H12O6]－，245[M－H－C16H12O8]－，161[MH－C21H20O8]－，125[M－H－C24H20O8]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10]，化合物29、33、38、41 可能是（表）兒茶素-（表）兒茶素n 和（表）兒茶素-（表）兒茶素（原花青素B）及其異構(gòu)體。峰35 和峰48 的母離子[M－H]－m/z 289 分子式為C15H14O6，特征碎片離子均有m/z 271[M－H－H2O]－，m/z 245[M－H－CO2]－，m/z 203[MH－C5H10O]－，m/z 179 [M－H－C6H6O2]－，m/z 151 [MH－C7H6O3]－，m/z 109[M－H－C9H12O4]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10]判斷其出峰順序，化合物35 和48 分別為兒茶素及表兒茶素。

4） 黃烷酮 峰62、峰65、峰68 和峰89 母離子[M－H]－m/z 433 分子式為C21H22O10，特征碎片離子均有m/z 285 [M－H－C5H8O5]－和271 [M－HC6H10O5]－。根據(jù)文獻(xiàn)[10]判斷出峰順序，化合物62可能是柚皮素-8-C-β-D-葡萄糖苷?；衔?5 可能是柚皮素-6-C-β-D-葡萄糖苷?；衔?8 可能是櫻桃苷?；衔?9 可能是柚皮素-4′-O-葡萄糖苷。峰80 的母離子[M－H]－m/z 271.0593，分子式為C15H12O5，特征碎片離子分別為m/z 151.0408[M－H－C8H8O]－和107.0126[M－H－C9H8O3]－，根據(jù)文獻(xiàn)[15]，化合物80 鑒定為柚皮素。

2.1.2 有機(jī)酸

1） 酚酸峰15 的母離子[M－H]－m/z 169.0138，分子式為C7H6O5，特征碎片離子分別為m/z 125.0382[M－H－CO2]－，96.9591[M－H－CO－CO2]－和79.1828[M－H－CO－CO2－H2O]－，根據(jù)文獻(xiàn)[10]，化合物15 可能是沒食子酸。峰20 和峰23 的母離子[M－H]－m/z 315.0707 和315.0705 分子式為C13H16O9，特征碎片離子都為m/z 153.0213[M－HC7H6O4]－和109.3178[M－H－CO2－C7H6O4]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物20 可能是原兒茶酸己糖苷，而化合物23 為其異構(gòu)體。峰22、峰34、峰37 和峰42 的母離子[M－H]－m/z 353，分子式為C16H18O9，特征碎片離子均為m/z 191 [M－H－C7H12O6]－，179 [M－HC9H8O4]－和135[M－H－CO2－C9H8O4]－，表明這幾個(gè)化合物為咖啡?？鼘幩幔–QA）的同分異構(gòu)體。Sun等[17]研究了咖啡?？鼘幩岢龇屙樞颉稳〈南疵擁樞?yàn)?-CQA＞5-CQA＞4-CQA＞1-CQA，化合物25，37，39 和45 分別是3-CQA，5-CQA，4-CQA 和1-CQA。峰30，峰39，峰44，峰55，的母離子[M－H]－m/z 為337，分子式為C16H18O8，特征碎片離子均為m/z 191[M－H－奎寧酸]－，163[M－H－香豆酸]－，根據(jù)文獻(xiàn)[19]，初步判斷4 種化合物的出峰順序，化合物30、39、44、55 分別是5-肉桂?？崴?、4-肉桂?？崴?、1-肉桂酰奎尼酸、5-O-肉桂酰奎寧酸。峰46 的母離子[M－H]－m/z 163.0393，分子式為C9H8O3，特征碎片離子分別為m/z 119.0496 [M－H－CO2]－，117.0386 [M－H－CH2O2]－和93.0342[M－H－C3H2O2]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物46 可能是對香豆酸。

2） 氨基酸峰16 的母離子[M－H]－m/z 164.0706，分子式為C9H11NO2，特征碎片離子分別為m/z 147.0617[M－H2O]－，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，化合物15可能是苯基丙氨酸。

2.2 基于PLS-DA 模型對廬山云霧茶真?zhèn)巫R(shí)別

圖2可以明顯看出典型與非典型（摻假綠茶）廬山云霧茶的指紋圖譜差異明顯。為進(jìn)一步對廬山云霧茶產(chǎn)地溯源分析，將所有廬山云霧茶樣本UPLC-QTOF-MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入MMP 軟件中進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。PLS-DA 是常見的有監(jiān)督判別分析，是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法。在一個(gè)算法下，同時(shí)實(shí)現(xiàn)回歸建模（多元線性回歸）、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡化（主成分分析）及兩組變量之間的相關(guān)性分析（典型相關(guān)性分析）。圖3為3 個(gè)產(chǎn)地廬山云霧茶及測試茶樣偏最小二乘判別分析的三維得分圖。紅色圓點(diǎn)代表通遠(yuǎn)鎮(zhèn)廬山云霧茶樣本，藍(lán)色圓點(diǎn)代表賽陽鎮(zhèn)廬山云霧茶樣本，棕色圓點(diǎn)代表星子縣廬山云霧茶樣本。灰色和綠色圓點(diǎn)都是測試茶樣，其中灰色的和正宗廬山云霧茶匯聚在了一側(cè)，判定這些茶葉樣本為正宗廬山云霧茶。而綠色的茶樣遠(yuǎn)離其它正宗廬山云霧茶，判定這些茶葉樣本為非廬山云霧茶。從得分圖中就能夠明顯區(qū)分摻假茶葉和正宗廬山云霧茶樣本，判別率為100%。

圖2 典型與非典型廬山云霧茶指紋圖譜Fig.2 Typical and atypical Lu Mountain Clouds-Mist Tea fingerprints

圖3 廬山云霧茶的偏最小二乘判別分析三維得分圖Fig.3 PLS-DA 3D score plots of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

表2 廬山云霧茶樣本PLS-DA 模型預(yù)測矩陣Table 2 PLS-DA training result views of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

圖4 廬山云霧茶PLS-DA 得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.4 PLS-DA score plots （a） and loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

圖4是廬山云霧茶PLS-DA 模型的得分圖（a）和載荷圖（b）。從得分圖中可知，廬山云霧茶樣本可以分為5 類，摻假綠茶（綠色的點(diǎn)）明顯遠(yuǎn)離其它4 類正宗廬山云霧茶。說明摻假綠茶可以很好的根據(jù)PLS-DA 模型區(qū)分出來。載荷圖中每一點(diǎn)代表一種潛在標(biāo)志物，離中心點(diǎn)和坐標(biāo)軸越遠(yuǎn)，對模型的影響越大，即對不同樣本的分組貢獻(xiàn)率越高。圖4中載荷圖（b）中最左邊和最右邊符號(hào)代表的化合物就是對典型與非典型廬山云霧茶分組貢獻(xiàn)最大的化合物。

模型預(yù)測矩陣如表2所示，根據(jù)概率統(tǒng)計(jì)，構(gòu)建的廬山云霧茶PLS-DA 模型能夠有效判別廬山云霧茶的產(chǎn)地。不同產(chǎn)地廬山云霧茶判別率為100%。說明本試驗(yàn)構(gòu)建的PLS-DA 模型能夠較好的區(qū)分摻假綠茶和正宗廬山云霧茶。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用UPLC-QTOF-MS 分析廬山云霧茶提取物中抗氧化活性成分，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步鑒定出93 種化合物，包括2種異黃酮，28 種黃酮醇，16 種黃烷醇，5 種黃 烷酮，11 種有機(jī)酸，4 種氨基酸，27 種酚酸。構(gòu)建PLS-DA 模型，結(jié)合模型預(yù)測矩陣結(jié)果，摻假綠茶與正宗廬山云霧茶能夠很好的區(qū)分開，判別率為100%。本研究為廬山云霧茶的真?zhèn)闻袆e建立了一種快速通用的方法。