駝乳生物活性肽的研究進(jìn)展

王瑞雪 伊 麗，2 吉日木圖，2*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善750306）

乳源性生物活性多肽是來(lái)源于各種乳蛋白，并與乳蛋白肽鏈的某些片段序列相同或相似，在乳蛋白中，或在其降解過(guò)程中得到的具有不同生物活性功能的肽類(lèi)[1]。近年來(lái)，由于乳源生物活性肽生物活性強(qiáng)、天然、安全、容易制備且來(lái)源廣泛，故成為乳品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在過(guò)去的幾十年里，研究者們利用不同的提取技術(shù)和方法，不斷從乳蛋白中發(fā)現(xiàn)新的生物活性肽。隨著組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于乳源生物活性肽的研究中，使得乳源生物活性肽的研究更加深入[2]。

駝乳源中的蛋白質(zhì)是生物活性肽的豐富來(lái)源地。駝乳蛋白質(zhì)主要分為乳清蛋白、酪蛋白和乳脂肪球膜蛋白。其中酪蛋白含量最高，占總蛋白質(zhì)含量的61.8%～88.5%[3]，并以β-酪蛋白（65%）和αs1-酪蛋白（22%）為主，其中β-酪蛋白含量遠(yuǎn)高于牛乳（39%），與人乳（65%）相近。乳清蛋白約占總蛋白質(zhì)含量的30%左右。與牛乳相比，駝乳中含有大量的乳鐵蛋白（1.74 mg/mL）、乳過(guò)氧化物酶（0.09 mg/mL）、溶菌酶（0.00015 mg/mL）和免疫球蛋白（1.54 mg/mL）等保護(hù)性蛋白（見(jiàn)表1）[4]。近年來(lái)，已有多項(xiàng)研究表明，駝乳不僅具有抗氧化，保肝，抗炎和抗菌等作用，還可用于治療肺結(jié)核和婦科疾病，輔助治療癌癥、糖尿病及預(yù)防兒童佝僂病等[5-6]。然而，相較于駝乳功能作用的研究，駝乳生物活性肽的研究起步較晚，本文將結(jié)合國(guó)內(nèi)外駝乳蛋白質(zhì)水解及發(fā)酵降解產(chǎn)生的特定生物活性肽及其生理功能進(jìn)行綜述。

1 駝乳蛋白生物活性肽的提取

1.1 酶解法

蛋白酶法水解駝乳蛋白是目前獲得生物活性肽普遍采用的一種方法。該法是在提取出的駝乳蛋白液中加入特定蛋白酶，通過(guò)設(shè)定不同反應(yīng)條件獲取酶解液，并經(jīng)過(guò)層析和高效液相色譜等方法對(duì)其酶解物進(jìn)行分離純化，獲取生物活性肽。不同蛋白酶水解會(huì)得到不同功效的肽段，其中駝乳酶解中使用最廣泛的為消化酶類(lèi)，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。此外，其它一些蛋白酶，如木瓜蛋白酶、小麥蛋白酶、嗜熱芽孢菌蛋白酶、堿性蛋白酶以及細(xì)菌和真菌中所含的酶也用來(lái)酶解駝乳蛋白質(zhì)。

表1 駝乳和牛乳蛋白含量對(duì)比[7]Table 1 Protein content of camel milk and cow milk contrast[7]

1.2 發(fā)酵液

利用微生物發(fā)酵液處理駝乳也可獲得豐富的活性多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基系統(tǒng)本身是高度蛋白酶解系統(tǒng)，與蛋白酶解系統(tǒng)原理相同，例如：乳酸桿菌的發(fā)酵液含有多種胞內(nèi)多肽酶[15]。發(fā)酵液分解蛋白質(zhì)與其含有的微生物息息相關(guān)，這與酶水解蛋白質(zhì)存在本質(zhì)上的差異。近來(lái)，很多研究闡明了這些酶的生化和遺傳特性。研究表明這些酶的活性與微生物的生長(zhǎng)條件密切相關(guān)。因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)微生物的生長(zhǎng)溫度、pH 和時(shí)間等物理因素，以及篩選發(fā)酵菌種，從而控制不同活性多肽的生成。最近很多研究表明，駝乳蛋白質(zhì)的微生物發(fā)酵液中，已發(fā)現(xiàn)諸如ACE 抑制肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化及抗菌肽等多種乳源性生物活性多肽。發(fā)酵液中的菌株，以瑞士乳酸桿菌和鼠李糖乳桿菌最為常用。研究表明，含有這兩種菌株的發(fā)酵液產(chǎn)物比蛋白酶水解產(chǎn)物能釋放更多種類(lèi)的ACE抑制肽。由于發(fā)酵液中存在多種微生物，因此分離出的肽段生物活性更加豐富，值得進(jìn)一步探索。

1.3 體外模擬腸胃消化液

體外模擬消化液即通過(guò)模擬動(dòng)物消化的生理特點(diǎn)，采用與動(dòng)物體內(nèi)相近的消化酶系統(tǒng)，模擬出相近消化環(huán)境從而分解蛋白。該法可直觀的反應(yīng)人體對(duì)于駝乳蛋白的消化吸收利用度。目前，駝乳蛋白消化的試驗(yàn)體系并不健全。例如，體外應(yīng)采用更復(fù)雜的消化方案進(jìn)行消化試驗(yàn)；應(yīng)模仿成人或嬰兒腸道模型或模仿不同的生理情況進(jìn)行消化試驗(yàn)。這個(gè)技術(shù)在開(kāi)發(fā)工業(yè)化生產(chǎn)駝乳制品等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

2 駝乳生物活性肽的分類(lèi)

目前已鑒定出許多駝乳中潛在的生物活性肽前體，這些生物活性肽前體可能具有潛在的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞調(diào)節(jié)、抗糖尿病、抗炎、抗高血壓、抗氧化以及礦物質(zhì)結(jié)合（含有磷酸絲氨酰殘基的酪蛋白磷酸肽）等功能[16]。表2中總結(jié)了近年來(lái)駝乳生物活性肽的研究進(jìn)展。目前，對(duì)于駝乳生物活性肽的研究主要集中在抗菌、抗氧化以及ACE 抑制活性3 個(gè)方面。國(guó)內(nèi)對(duì)于駝乳肽的研究尚少，國(guó)外研究居多。國(guó)外大多數(shù)為單峰駱駝種，國(guó)內(nèi)駱駝主要以雙峰駝為主，存在品種差異，因此駝乳中的生物活性肽可能產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，有待進(jìn)一步研究鑒定。

2.1 抗菌肽

抗菌肽又稱(chēng)為肽類(lèi)抗生素，是生物體產(chǎn)生的具有抗菌作用的小分子蛋白質(zhì)，是宿主先天性非特異性防御系統(tǒng)的重要組分?？咕牡陌被釘?shù)目小于100，常帶正電荷，能殺傷細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)，還能抑制病毒的繁殖以及特定腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

目前，乳源抗菌肽的研究主要集中于牛乳和羊乳，有關(guān)駝乳抗菌肽的研究極少。Noreddine 等[17]將未處理的駝乳和牛乳進(jìn)行抑制效果比較，結(jié)果表明駝乳的抑菌效果較為顯著。Jrad 等[28]利用駝乳蛋白酶水解產(chǎn)物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，駱駝初乳的抗菌活性高于牛乳，且經(jīng)過(guò)與未處理原乳的對(duì)比試驗(yàn)得出蛋白酶解后釋放出更多具有抗菌活性的肽的結(jié)論。文獻(xiàn)[28]中確定了181 種肽，其中25 種肽的序列呈同源性，且蛋白質(zhì)片段具有多種潛在的生理活性。2014年Lafta 等[40]將駝乳經(jīng)嗜熱鏈球菌和德氏保加利亞亞種乳桿菌發(fā)酵處理，獲得具有抗菌活性的肽段。由此看來(lái)，駝乳作為天然且豐富的抗菌肽來(lái)源仍需深入研究。

2.2 抗氧化肽

自由基對(duì)人體的危害非常大，不僅會(huì)破壞DNA 組織，導(dǎo)致基因突變，還會(huì)干擾體內(nèi)系統(tǒng)的運(yùn)作，以致產(chǎn)生更多自由基，其連鎖反應(yīng)可導(dǎo)致自由基危害遍及全身。抗氧化肽是具有較強(qiáng)的抑制生物大分子過(guò)氧化和清除體內(nèi)自由基功能的肽類(lèi)。一般認(rèn)為，抗氧化肽的抗氧化活性與多肽的相對(duì)分子質(zhì)量大小、氨基酸序列、氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)以及金屬鹽絡(luò)合有關(guān)?？寡趸牡目寡趸钚杂善浞肿庸涞哪芰妥陨斫Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性決定?？寡趸牡淖饔脵C(jī)理是直接作用在自由基，或間接消耗容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)。抗氧化肽是目前的研究熱點(diǎn)，抗氧化肽對(duì)抑制、延緩脂質(zhì)氧化，保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害有特定作用。目前，駝乳抗氧化肽抗氧化活性的測(cè)定方法包含ABTS （總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒法）法、DPPH （廣泛用于定量測(cè)定生物試樣和食品的抗氧化能力）法和FRAP（亞鐵還原能力實(shí)驗(yàn)，廣泛運(yùn)用于食品與保健品的抗氧化能力分析。不僅能夠證明膜的流動(dòng)性，同時(shí)也能測(cè)量膜蛋白擴(kuò)散速率）法，并發(fā)現(xiàn)駝乳蛋白質(zhì)的水解程度隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其中，DPPH 法使用最廣泛[25]。

表2 駝乳生物活性肽的研究Table 2 Study on camel milk bioactive peptides

（續(xù)表2）

Homayounitabrizi 等[35]使用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解駝乳和牛乳并提取具有生物活性的肽級(jí)組分，共鑒定出3 種具有抗氧化能力的肽。Hatmi 等[31]發(fā)現(xiàn)用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵駝乳制備的5～10 ku 的肽段具有很高的自由基清除活性。Balakrishnan 等[27]報(bào)道，經(jīng)戊糖片球菌發(fā)酵的駝乳也得到了具有抗氧化活性的肽段，然而其抗氧化活性不及同樣方式發(fā)酵的山羊乳。Salami 等[24]發(fā)現(xiàn)駝乳清蛋白胰蛋白酶和糜蛋白酶水解物的抗氧化水平低于牛乳清蛋白，并且駝乳和牛乳的酪蛋白比乳清蛋白更容易被糜蛋白酶酶解。Abderrahmane 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，與牛乳清蛋白相比，駝乳清蛋白更容易被胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。哺乳動(dòng)物不同物種的同源蛋白質(zhì)之間由于氨基酸序列存在差異，因此產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不同。事實(shí)上，駝乳酪蛋白與牛乳酪蛋白顯示較低的氨基酸同一性。根據(jù)發(fā)酵乳對(duì)比得出，牛的發(fā)酵乳更容易被蛋白酶水解，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵牛乳具有更多可供酶水解的位點(diǎn)。這解釋了為什么駝乳酪蛋白產(chǎn)生的潛在生物活性肽與從牛乳酪蛋白中獲得的生物活性肽不同[31]。與模擬胃腸消化相比，菌株發(fā)酵在水解蛋白質(zhì)過(guò)程中裂解的蛋白位點(diǎn)不同，所釋放的生物活性肽功能也不同[31]。在駝乳中，Hatmi 等[31]觀察到，用嗜熱鏈球菌發(fā)酵制備的肽段比通過(guò)模擬胃腸消化獲得的肽段具有更強(qiáng)的自由基清除活性[28]。Moslehishad 等[25]研究表明以鼠李糖乳桿菌PTCC 1637 發(fā)酵產(chǎn)生的肽段，其自由基清除力比胃（胃蛋白酶）或胰腺（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）酶產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物強(qiáng)，可能由于水解物的氨基酸組成不同所致[24]。由于發(fā)酵乳制品具有較高的感官品質(zhì)，因此乳酸菌發(fā)酵的駝乳制品越來(lái)越多。根據(jù)以上研究可知，無(wú)論是通過(guò)蛋白酶解還是發(fā)酵駝乳均可獲得具有較高抗氧化活性成分的肽段，因此駝乳是很好的天然抗氧化劑[18]。

2.3 ACE 抑制肽

ACE（具有降血壓活性的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）是一種膜結(jié)合的二肽羧基酶，廣泛存在于人體組織及血漿中，在肺毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的含量最為豐富[42]。ACE 是多功能酶，在體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）中，對(duì)血壓的調(diào)節(jié)起著重要作用。對(duì)于體外試驗(yàn)，大多數(shù)使 用HHL 或FAGPP 法，來(lái)測(cè)定ACE 活性。Shuang 等[36]在含有瑞士乳桿菌130B4 的發(fā)酵駝乳中觀察到ACE 抑制活性。通過(guò)反相高效液相色譜從發(fā)酵乳中純化出抑制ACE 的肽。該肽的氨基酸序列被鑒定為：Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp（IC50=19.9 μmol/L）。在來(lái)自牛乳的酪蛋白（-CNf107-115）中發(fā)現(xiàn)相同的氨基酸序列。即使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶連續(xù)消化后，該肽（-CN f107-115）的抑制活性幾乎保持不變。并且，純化肽的抑制活性在100 ℃熱處理20 min后完全保留。因此得出結(jié)論：瑞士乳桿菌130B4 制備的發(fā)酵乳含有ACE 抑制肽（-CN f107-115）。由于該肽對(duì)消化蛋白酶和體外熱處理穩(wěn)定，因此認(rèn)為該發(fā)酵乳可能具有抗高血壓的作用。Tagliazucchi 等[37]通過(guò)模擬胃腸消化液消化駝乳，確定了駝乳中的幾種ACE 抑制肽。值得注意的是，試驗(yàn)過(guò)程中鑒定了3 種ACE 抑制肽（即三肽IPP），而之前牛乳抗高血壓的作用和動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用就是以三肽IPP 的發(fā)現(xiàn)而聞名[43]。此外，駝乳κ-酪蛋白經(jīng)消化后釋放的IPP 量約為2.56 mg/L，該劑量下IPP 具有顯著降血壓作用。高血壓相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，每日攝入2～6 mg 的IPP 可以使血壓下降1.5～10 mg Hg[37]。這是第一次在駝乳蛋白質(zhì)中鑒定出已知具有體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)的肽。

2.4 其它生物活性肽

Agrawal 等[44]發(fā)現(xiàn)用駝乳中分子質(zhì)量低于10 ku 的肽培養(yǎng)（HEK293）細(xì)胞，能表達(dá)對(duì)人胰島素受體（hIR）具有活化作用（人胰島素的分子質(zhì)量為5 807 u）的胰島素肽。駝乳的這種胰島素肽可以顯著降血糖活性[44]。Nongonierma 等[45]在駝乳胰蛋白酶的水解物中鑒定出9 種新型DPP-IV（二肽基肽酶IV） 抑制肽（FLQY，F(xiàn)QLGASPY，ILDKEGIDY，ILELA，LLQLEAIR，LPVP，LQALHQGQIV，MPVQA和SPVVPF），并確定了DPP-IV 的最大抑制濃度（IC50）。該項(xiàng)研究表明，在相同水解條件下產(chǎn)生的駝乳和牛乳蛋白質(zhì)水解物中鑒定出DPP-IV 抑制肽的序列不同。這與駝乳和牛乳蛋白質(zhì)肽鍵裂解酶的選擇性差異以及氨基酸序列的差異有關(guān)。該新型DPP-IV 抑制肽可能在調(diào)節(jié)人類(lèi)血糖中起非常重要的作用。此外，Homayounitabrizi 等[35]研究了駝乳胃蛋白酶和胰蛋白酶水解物對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。HepG2 細(xì)胞來(lái)源于一個(gè)15 歲白人的肝癌組織。研究表明，從駝乳中提取并純化的肽對(duì)HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有緩解作用，此研究為駝乳多肽在抑制或預(yù)防腫瘤和癌癥方面提供參考依據(jù)。

3 結(jié)論

乳源活性肽具有多種生物活性，其來(lái)源于天然乳蛋白，具有極高的食品安全性。同時(shí)，乳源活性肽衍生的高品質(zhì)乳制品的開(kāi)發(fā)可將該地區(qū)的資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。因此，乳源活性肽成為當(dāng)前國(guó)際食品界極具發(fā)展前景的研究課題。由于乳源生物活性肽既可作為食品添加劑，又可作為保健食品的功能成分，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

駱駝作為我國(guó)荒漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，對(duì)于牧區(qū)人民的生產(chǎn)、生活以及牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有極其重要的意義。駱駝乳營(yíng)養(yǎng)成分接近人乳，蛋白構(gòu)成比例合理，具有多種生物活性物質(zhì)，致敏性低，可作為牛乳過(guò)敏人群的替代乳，因此具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)[46]，2014年，僅阿拉伯國(guó)家駝乳制品消費(fèi)者就達(dá)2億，全球市場(chǎng)潛在價(jià)值達(dá)100 億美元，現(xiàn)有產(chǎn)品的種類(lèi)和規(guī)模已不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。因此，大力推動(dòng)駝乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展，幫助干旱和半干旱地區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)很有必要。鑒于駱駝乳業(yè)極強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿?，很多?guó)家和地區(qū)都致力于發(fā)展當(dāng)?shù)氐鸟橊勷B(yǎng)殖業(yè)和駝乳加工業(yè)。除非洲、阿拉伯地區(qū)和中亞地區(qū)等駱駝乳傳統(tǒng)消費(fèi)地區(qū)外，歐洲也已允許進(jìn)口駝乳及駝乳制品。美國(guó)也已開(kāi)始養(yǎng)殖駱駝，生產(chǎn)銷(xiāo)售駝乳及駱駝乳香皂等產(chǎn)品，駝乳市場(chǎng)正向發(fā)達(dá)國(guó)家擴(kuò)張[46]。從全球范圍來(lái)看，我國(guó)駝乳產(chǎn)業(yè)還比較弱小，沒(méi)有形成規(guī)模和產(chǎn)業(yè)鏈，有待各地政策支持和科技力量注入，推動(dòng)我國(guó)駝乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展。