濃縮對(duì)千禧番茄中番茄紅素分子構(gòu)象的影響

才美慧 張 超 馬 越，4 趙曉燕，5 李 斌

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 遼寧沈陽110866 2 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心 北京100097 3 果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100097 4 農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100097 5 農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100097）

番茄紅素分子式為C40H56，屬于高度不飽和結(jié)構(gòu)，在天然狀態(tài)下，番茄紅素分子以全反式構(gòu)型為主，存在數(shù)十種異構(gòu)體，一般全反式番茄紅素占總量的80%～97%[1-2]。研究顯示：順式番茄紅素比全反式番茄紅素具有更高的生物利用率和生物活性，可以優(yōu)先被胃腸道吸收，并顯示出更高的抗氧化活性[3-5]。

番茄醬是番茄的主要加工制品，其順式番茄紅素含量主要與番茄品種和生產(chǎn)工藝參數(shù)相關(guān)。研究顯示加熱處理是引起番茄紅素降解和異構(gòu)化的重要因素。Lee 等[6]發(fā)現(xiàn)番茄紅素在50 ℃和100℃加熱初期表現(xiàn)出異構(gòu)化，隨著加熱時(shí)間的延長而發(fā)生降解；Shi 等[7]研究表明番茄泥在較低溫度下加熱利于異構(gòu)化，其中60 ℃、3 h 條件下總順式番茄紅素增加了18.8%。然而，對(duì)于番茄醬濃縮過程中番茄紅素分子構(gòu)象變化的系統(tǒng)研究還鮮有報(bào)道。

本研究以順式番茄紅素含量較高的千禧番茄為原料，采用光譜和色譜結(jié)合的方法鑒定番茄中番茄紅素分子構(gòu)象，模擬濃縮生產(chǎn)過程，研究濃縮溫度和濃縮時(shí)間對(duì)番茄醬中番茄紅素分子構(gòu)象的影響，闡明濃縮加熱過程對(duì)番茄紅素構(gòu)象的影響規(guī)律，為番茄醬產(chǎn)業(yè)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

市售海南千禧番茄。試劑：正己烷、甲醇、甲基叔丁基醚為色譜純級(jí)；乙醇，丙酮為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

PL3002 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；榨汁機(jī)HR 2377/E，Philips；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-25，瑞士Buchi 公司；離心機(jī)，北京博宇寶感實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；Agilent1200 系列高效液相色譜儀（配有四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD 檢測(cè)器）、Agilent1290-6530 質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

精確（0.0001 g）稱取全反式番茄紅素標(biāo)品1 mg，溶解于甲醇∶氯仿=1∶1（體積比）中，配制成1 mg/mL 的溶液，精確量取一定體積，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.00，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜分析。通過質(zhì)量濃度-峰面積線性回歸，得到回歸曲線和方程，計(jì)算R2值。通過比較其在相同條件下分析的全反式番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間和峰面積，在番茄紅素提取物中進(jìn)行鑒定和定量。

1.4 番茄醬的濃縮生產(chǎn)過程

選擇無黑斑、無青果、無損的番茄在10 ℃貯藏24 h，用蒸餾水洗滌，離心機(jī)脫水，使用轉(zhuǎn)速為18 000 r/min 的榨汁機(jī)冷破碎打漿3 min，單層紗布過濾出皮籽后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。使用不同的濃縮時(shí)間和溫度進(jìn)行番茄醬濃縮：（1）將濃縮溫度設(shè)定在60 ℃，濃縮時(shí)間分別為2，3，4，5 h，將番茄汁濃縮成醬；具體操作：在濃縮的第1 小時(shí)內(nèi)，濃縮壓力為150 mbar，2，3，4，5 h 處理組在剩余時(shí)間的壓力分別設(shè)定為70，100，120，140 mbar；（2）將濃縮時(shí)間設(shè)定在3 h，濃縮溫度分別為40，50，60，70 ℃，將番茄汁濃縮成醬；具體操作：在濃縮的第1 小時(shí)內(nèi)，濃縮壓力設(shè)定為150 mbar，50，60，70℃處理組在剩余時(shí)間的壓力分別設(shè)定為20，50，100，170 mbar。上述番茄醬均濃縮至可溶性固形物30°左右，然后稀釋至29.5°，放置于4 ℃冷藏備用。

1.5 番茄紅素的提取

采用有機(jī)溶劑浸提法提取樣品中的番茄紅素。將1 g 樣品每次加入10 mL 正己烷-丙酮-乙醇（體積比為50∶25∶25）提取3 次至無色，混合提取液在5 ℃和9 500 r/min 條件下離心15 min。將上清液放入分液漏斗，添加5 mL 超純水，振蕩后分層，除去水相，重復(fù)上述萃取操作得到樣品。

1.6 番茄紅素的分離及其構(gòu)象鑒定

選擇YMC Carotenoid C30 色譜柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）、甲基叔丁基醚（B），梯度洗脫條件0 min 55%B，0～6 min B增加至85%，6～16 min B 保持85%不變，16～18 min B 降至55%，流速：0.5 mL/min，分析時(shí)間21 min；柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長：470 nm，DAD 光譜收集范圍：200～800 nm。質(zhì)譜離子源為APCI（+），質(zhì)量范圍：50～800 m/z；干燥器溫度：300 ℃；干燥流量：8 L/min；霧化器壓力45 psi；采集頻率：2 Hz。

從HPLC 圖中提取各組分峰值最高點(diǎn)的全波長掃描圖，鑒別番茄紅素異構(gòu)體并截取270～600 nm 的特征區(qū)域。然后根據(jù)其光譜信息計(jì)算Q 值，即在361～362 nm 波長處出現(xiàn)的順式特征吸收峰與最大吸收波長的主吸收峰強(qiáng)度的比值，再結(jié)合特征吸收峰位置及單峰保留時(shí)間具體鑒別番茄紅素異構(gòu)體。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

圖像采用美國Origin Lab Corporation 公司Origin 8.0 軟件繪制，所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用DPS 軟件進(jìn)行方差分析（P＜0.05），試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將6 個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各取10 μL 進(jìn)樣，圖1a 是全反式番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL 條件下的HPLC 圖，保留時(shí)間15.37 min。在每個(gè)色譜圖上，得到峰面積，做質(zhì)量濃度-峰面積線性回歸，得到線性回歸曲線圖1b 和回歸方程：y=24946.91x （R2=0.9987），線性區(qū)間為20～200.0 μg/mL。

2.2 番茄紅素構(gòu)象鑒定

采用HPLC 對(duì)千禧番茄中番茄紅素異構(gòu)體進(jìn)行分離，結(jié)合質(zhì)譜信息和紫外光譜信息對(duì)樣品中番茄紅素分子構(gòu)象進(jìn)行分析。圖2中HPLC 在470 nm 的光譜圖顯示共有8 個(gè)主要吸收峰，與提取離子流圖（m/z 537.4443）的8 個(gè)主要響應(yīng)峰吻合，因此，HPLC 在470 nm 光譜圖上的8 個(gè)主要吸收峰中均有m/z 537.4443 的離子。圖3顯示峰7 的二級(jí)質(zhì)譜圖，該圖與其它7 個(gè)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖基本相似，可以發(fā)現(xiàn)m/z 537.4443 的離子碎片離子主要包括m/z 455.3651 和m/z 413.3180，其中，m/z 455.3651 是從番茄紅素分子C40H56中裂解脫去-C6H12形成的，m/z 413.3180 是從番茄紅素分子C40H56中裂解脫去-C9H18而形成，與陳冬東等[8]的報(bào)道一致。因此，HPLC 在470 nm 光譜圖的8 個(gè)主要吸收峰應(yīng)為番茄紅素分子。

圖1 全反式番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC（470 nm）（a）和質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸（b）Fig.1 HPLC chromatogram （470 nm） （a） and linear regression of mass concentration and peak area （b）for all-trans lycopene standards

圖2 千禧番茄的HPLC（470 nm）（a）和提取離子流圖（b）Fig.2 HPLC chromatogram （470 nm） （a） and extracted ion chromatogram （b） of Qianxi tomato

圖3 番茄紅素m/z 537.4443 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2 of m/z 537.4443

進(jìn)一步采用吸收峰的紫外吸收光譜“山字峰”的特征[9-10]及Q 值[7]對(duì)其分子構(gòu)象進(jìn)行鑒別（圖4）。峰1 的保留時(shí)間為8.68 min，紫外光譜的光譜特征吸收峰為345，412，436，464 nm，Q 值為0.15，初步鑒別為X1-順式番茄紅素；峰2 的保留時(shí)間是9.60 min，吸收峰分別為363，427，452，478 nm，Q 值為0.07，初步鑒別為X2-順式番茄紅素；峰3 的保留時(shí)間為9.98 min，吸收峰分別為360，431，457，487 nm，Q 值為0.06，初步鑒別出9，13-二順式番茄紅素；峰4 的保留時(shí)間為11.79 min，吸收峰分別為360，444，469，500 nm，Q 值為0.75，初步鑒別出15-順式番茄紅素；峰5 的保留時(shí)間分別為12.15 min，吸收峰分別為361，439，465，495 nm，Q 值為0.55，初步鑒別出13-順式番茄紅素；峰6 的保留時(shí)間分別為13.81 min，吸收峰分別為366，446，

471，501 nm，Q 值為0.11，初步鑒別出9-順式番茄

紅素；峰7 的保留時(shí)間為15.37 min，對(duì)應(yīng)的吸收峰分別為363，446，471，502 nm，在361～362 nm左右處出現(xiàn)的順式特征吸收峰與最大吸收波長的主吸收峰強(qiáng)度的比值即Q 值為0.07，通過與全反式番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)一致，鑒別出全反式番茄紅素；峰8 的光譜信息與全反式番茄紅素一致，依據(jù)其含量和出峰順序可以初步鑒別出5-順式番茄紅素。

圖4 峰1～8 的紫外光譜Fig.4 UV spectrum of peak 1-8

2.3 濃縮過程對(duì)總番茄紅素含量的影響

圖5研究濃縮時(shí)間對(duì)總番茄紅素含量的影響，千禧中總番茄紅素含量為0.533 mg/g，不同濃縮時(shí)間使得總番茄紅素的降解程度不同，適當(dāng)加熱可以增強(qiáng)番茄基質(zhì)中番茄紅素的提取能力[7]，濃縮時(shí)間4 h 總番茄紅素含量相對(duì)最高為0.449 mg/g，然而與2 h 和3 h 相比沒有顯著性差異；隨濃縮時(shí)間的延長，5 h 時(shí)總番茄紅素降解顯著，與對(duì)照相比下降了36.0%。Takeoka 等[11]的研究表明將番茄汁加工至可溶性固形物達(dá)到25～30°，期間損失的番茄紅素含量最高值為28%，加工時(shí)間影響番茄紅素的含量。圖6顯示了濃縮溫度對(duì)其影響，隨著濃縮溫度升高，總番茄紅素呈逐漸降低的趨勢(shì)，40，50，60，70 ℃與對(duì)照相 比分別 降低了7.7%，21.8%，22.3%，32.6%。張貞理等[12]的研究同樣得出隨著溫度的升高，萃取物中番茄紅素的穩(wěn)定性急劇下降的結(jié)果，與文中結(jié)論一致。

圖5 濃縮時(shí)間對(duì)總番茄紅素含量的影響Fig.5 Effect of concentration time on the content of lycopene

圖6 濃縮溫度對(duì)總番茄紅素含量的影響Fig.6 Effect of concentration temperature on the content of lycopene

2.4 濃縮時(shí)間對(duì)番茄紅素構(gòu)象的影響

表1顯示濃縮時(shí)間對(duì)番茄醬中峰1～8 含量的影響，發(fā)現(xiàn)15-順式番茄紅素（峰4）在濃縮2 h 后可以檢出，約占總番茄紅素的0.54%，當(dāng)濃縮時(shí)間為5 h 時(shí)占比增加至0.87%，比2 h 增加了0.61倍。經(jīng)2，3，4，5 h 濃縮后，13-順式番茄紅素（峰5）含量顯著增加，比對(duì)照分別增加了0.72，1.14，1.25，1.58 倍，與2 h 相比增長了0.51 倍。9-順式番茄紅素（峰6）濃縮后含量略微增加，可能是因?yàn)槠湓谒许樖疆悩?gòu)體中非常穩(wěn)定[13]。9，13-二順式番茄紅素（峰3）在濃縮時(shí)間為2 h 后可檢出1.29%，隨著濃縮時(shí)間的延長，峰3 呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)；當(dāng)濃縮時(shí)間為5 h 時(shí)，占比增加至1.41%，與2 h 相比增加了0.09 倍。根據(jù)番茄紅素異構(gòu)體在濃縮過程中的變化，初步判斷出穩(wěn)定性：峰4＜峰5＜峰3＜峰6，與Ferruzzi 等[14]的單順式番茄紅素異構(gòu)體研究結(jié)果一致。研究表明，番茄紅素順式異構(gòu)體不僅由全反式番茄紅素異構(gòu)而來，它們之間也會(huì)存在轉(zhuǎn)化[9]，二順式番茄紅素部分含量的增加有可能是由單順式番茄紅素轉(zhuǎn)化而來[6]。盡管如此，加工濃縮過程中番茄紅素的異構(gòu)化主要是全反式向順式番茄紅素的轉(zhuǎn)化，對(duì)照組全反式番茄紅素（峰7）含量為85.39%，隨著濃縮時(shí)間的延長，峰7 分別下降了5.30%，7.77%，7.93%和9.28%，說明番茄醬濃縮時(shí)間影響番茄紅素異構(gòu)體的穩(wěn)定性，濃縮時(shí)間越長，異構(gòu)化越顯著。Chasse 等[15]研究表明，平衡狀態(tài)下全反式番茄紅素與5-順式番茄紅素含量較高，而9-順式番茄紅素和13-順式番茄紅素含量相對(duì)較少；處理后全反式番茄紅素主要轉(zhuǎn)化為13-順式番茄紅素且穩(wěn)定性差[16]，與本文結(jié)論一致。

表1 濃縮時(shí)間對(duì)番茄醬中峰1～8 含量的影響Table 1 Effect of concentration time on the content of peak 1-8

研究顯示，順式番茄紅素異構(gòu)體之間的鐵還原能力測(cè)定及ABTS 自由基陽離子清除能力之間沒有顯著性差異，而清除過氧化氫能力均優(yōu)于反式異構(gòu)體，且生物利用度高[17]。研究顯示隨著濃縮時(shí)間的延長，總順式異構(gòu)體含量增加，其中，在0～3 h 中，總順式異構(gòu)體含量增加53.2%，在3～5 h中，總順式異構(gòu)體含量增加6.7%。結(jié)合總番茄紅素含量，從順式番茄紅素含量提高的角度分析，在60 ℃加熱濃縮3 h 或4 h 是比較適宜的工藝參數(shù)。

2.5 濃縮溫度對(duì)番茄紅素構(gòu)象的影響

溫度是影響番茄紅素異構(gòu)化和降解的重要因素。由表2可以看出15-順式番茄紅素在濃縮溫度為40 ℃后可以檢出，約占總番茄紅素的0.66%，當(dāng)濃縮溫度為70 ℃時(shí)占比增加至0.84%，與40 ℃相比增加了0.27 倍。13-順式番茄紅素在不同濃縮溫度下含量增加，與對(duì)照相比分別增加了0.99，1.00，1.14，1.22 倍；70 ℃與40 ℃相比增加了0.113倍。5-順式番茄紅素在所選擇的溫度間差異并不顯著，與對(duì)照相比略有增加。9，13-二順式番茄紅素在濃縮溫度為70 ℃時(shí)含量增加至1.40%，比最低溫度40 ℃增加了0.10 倍。全反式番茄紅素含量隨著順式番茄紅素含量的增加而降低，與對(duì)照相比分別降低了6.01%，6.64%，7.78%和8.26%。50，60，70 ℃與40 ℃相比分別降低了0.008，0.022 和0.028 倍。表明溫度一定程度上影響番茄紅素的異構(gòu)化，高溫會(huì)加快異構(gòu)化反應(yīng)速率。Colle 等[18]將番茄紅素油在80，90 ℃加熱1 h 發(fā)現(xiàn)總順式番茄紅素和全反式番茄紅素的異構(gòu)化不明顯；在不考慮加熱時(shí)間的情況下，番茄紅素在低于100 ℃下加熱相對(duì)穩(wěn)定[19]；高溫可以顯著改善體外番茄紅素的生物有效率[20]，根據(jù)其營養(yǎng)價(jià)值給出加工過程濃縮溫度參考值為40 ℃和60 ℃，對(duì)應(yīng)的總順式番茄紅素含量分別為0.101 mg/g 和0.093 mg/g。

表2 濃縮溫度對(duì)番茄醬中峰1～8 含量的影響Table 2 Effect of concentration temperature on the content of peak 1-8

3 結(jié)論

采用HPLC 和質(zhì)譜聯(lián)用的方式確定番茄紅素組分的含量，采用“山字峰”的特征及Q 值確定番茄紅素組分的構(gòu)象，在千禧番茄中共鑒定出8 種番茄紅素，分別為X1-順式番茄紅素、X2-順式番茄紅素、9，13-二順式番茄紅素、15-順式番茄紅素、13-順式番茄紅素、9-順式番茄紅素、全反式番茄紅素和5-順式番茄紅素。根據(jù)番茄紅素分子在濃縮過程中的變化率，各組分穩(wěn)定性強(qiáng)弱為：9-順式番茄紅素>13-順式番茄紅素>9，13-二順式番茄紅素>15-順式番茄紅素。千禧番茄濃縮成番茄醬使得總番茄紅素產(chǎn)生不同程度降解，濃縮時(shí)間為5 h 時(shí)降幅最大為36%，濃縮溫度的升高能夠造成番茄紅素含量的顯著降低。濃縮生產(chǎn)過程使得番茄紅素異構(gòu)體向順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，營養(yǎng)價(jià)值提高，建議濃縮過程參考值為3 h、60 ℃。