薄荷油納米乳液的穩(wěn)定機(jī)制及抑菌特性

張瀟元 潘 悅 王中江 江連洲 車(chē)佳玲 朱一方 鐘春艷

（1 北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所 北京100097 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

納米乳液是粒徑在10～200 nm 之間的一種乳化運(yùn)輸體系，與常規(guī)微米級(jí)液滴粒徑的乳液相比，納米級(jí)粒徑的乳液賦予體系特殊的小尺寸、高表面活性和強(qiáng)吸附等特性，進(jìn)而對(duì)體系的物理化學(xué)穩(wěn)定性和所運(yùn)載營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的體內(nèi)吸收起到增強(qiáng)效果。同時(shí)，通過(guò)納米乳液針對(duì)特定功能性物質(zhì)而構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)素的包埋與傳遞，在極大程度上解決了揮發(fā)型營(yíng)養(yǎng)素水性介質(zhì)中溶解度差，生物利用率低，易揮發(fā)，易氧化，對(duì)光、熱敏感等問(wèn)題。納米乳液在貯存過(guò)程中無(wú)絮凝、聚集、沉淀、奧斯特瓦爾德熟化現(xiàn)象[1]，被看成是一種“近熱力學(xué)穩(wěn)定”體系[2]。

近年來(lái)，制備納米乳液的方法大致可分為低能乳化法和高能乳化法，其中高能乳化法主要利用高壓微射流、高壓均質(zhì)機(jī)和超聲波處理。高壓均質(zhì)法作為制備納米乳液的主要方法，其原理是將制備好的粗乳液隨高壓通過(guò)細(xì)小的均質(zhì)頭，經(jīng)過(guò)強(qiáng)烈振動(dòng)和液壓剪切作用，使粗乳液形成極小粒徑的乳液。Chu 等[3]采用高壓均質(zhì)結(jié)合有機(jī)溶劑揮發(fā)的方法，通過(guò)向油相中加入揮發(fā)性有機(jī)溶劑，形成乳液后再蒸發(fā)油相液滴內(nèi)的有機(jī)溶劑，降低分散相液滴粒徑，成功制備了以酪蛋白酸鈉為乳化劑粒徑17 nm 的β-胡蘿卜素納米分散體。Chu 等[4]研究了以該方法制備納米乳液的物理穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以酪蛋白酸鈉為乳化劑時(shí)乳液表現(xiàn)出很好的抗熱、酸和離子強(qiáng)度的作用。然而，隨著人們對(duì)食品安全以及納米顆粒潛在生物毒性關(guān)注度的提高，這些合成或半合成的化學(xué)乳化劑在食品配方中的使用引起人們的普遍擔(dān)心。選用一種較為安全的生物兼容乳化劑，是現(xiàn)在研究的重點(diǎn)[5]。

本研究以大豆分離蛋白、磷脂酰膽堿為乳化劑，通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)乳化制備薄荷油納米乳液，研究薄荷油納米乳液的微觀(guān)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和抑菌特性，為制備均一、穩(wěn)定的薄荷油納米乳液，提高薄荷油的穩(wěn)定性和生物利用度提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 （Soybean protein isolate，SPI）蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.21%，山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)；磷脂酰膽堿（Phosphatidyl choline，PC），北京索萊寶科技有限公司；薄荷油、胰酪胨大豆肉湯、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂、甘油，美國(guó)Sigma 公司；單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫微生物菌種保藏管理中心；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純級(jí)試劑。

1.2 設(shè)備與儀器

T18 Basic 型高速分散機(jī)，德國(guó)IKA 公司；實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)，英國(guó)Stansted Fluid Power 公司；超凈工作臺(tái)，美國(guó)PE 公司；激光掃描3D 共聚焦顯微鏡，英國(guó)Malvern 儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSP 型納米粒徑電位儀，英國(guó)Malvern 儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 薄荷油納米乳液的制備 參照Lee 等[6]的方法將SPI 和PC 溶于0.1 mol/L、pH 值7.0 的磷酸鹽緩沖液中，置于25 ℃條件下連續(xù)攪拌120 min，形成水相，在高速分散器的攪拌下把薄荷油作為油相加到水相中，20 000 r/min 剪切5 min，形成粗乳液。將粗乳液通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)一步均質(zhì)乳化即得薄荷油納米乳液。高壓均質(zhì)處理方法及條件設(shè)定參考Sorgentini 等[7]并略做修改。高壓均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)壓力為80 MPa，均質(zhì)次數(shù)4 次，采用冰水浴保持低溫。

1.3.2 納米乳液的冷凍掃描電鏡觀(guān)察 使用冷凍掃描電鏡觀(guān)察薄荷油納米乳液的微觀(guān)結(jié)構(gòu)[8]。將1滴納米乳液浸泡在約-180 ℃的液態(tài)氮泥漿中。將樣品在真空條件下轉(zhuǎn)移到低溫電子顯微鏡樣品制備室。在-90 ℃制備室內(nèi)，使用精密的旋轉(zhuǎn)刀將冷凍樣本斷裂并升華3 min。隨后置于離子濺射儀的樣品艙中，在11 mA 的電流下噴金2 min，樣品取出后，裝入掃描電子顯微鏡觀(guān)察室進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.3 納米乳液的穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.3.1 pH 值 用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)薄荷油納米乳液pH 值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，靜置2 h 后，測(cè)定乳液的平均粒徑、ζ 電位和濁度。

1.3.3.2 離子強(qiáng)度配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L 的NaCl 溶液和0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mol/L 的CaCl2溶液。將薄荷油納米乳液用不同濃度的NaCl 溶液和CaCl2溶液稀釋1 倍，靜置2 h后，測(cè)定乳液平均粒徑、ζ 電位和濁度。

1.3.3.3 冷凍-融化 將薄荷油納米乳液在-18℃冷凍24 h，于室溫（25 ℃）解凍，測(cè)定乳液平均粒徑、ζ 電位和濁度。

1.3.3.4 納米乳液的貯藏穩(wěn)定性分析 將制備的薄荷油納米乳液分別于4，25，55 ℃放置30 d，每5 d 測(cè)定1 次乳液的平均粒徑、ζ 電位、薄荷油的保留率。

1.3.3.5 納米乳液中薄荷油含量測(cè)定 薄荷油含量的測(cè)定參考Kim 等[9]的方法并略做修改，稱(chēng)取適量制備好的薄荷油納米乳液與少量水均勻混合，再倒入300 mL 去離子水，常壓水蒸氣蒸餾1.5 h后，待油柱高度在一定時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變化時(shí)，記錄油柱體積V。

1.3.3.6 貯藏過(guò)程中薄荷油保留率測(cè)定 采用1.3.3.5 節(jié)中的方法，測(cè)定其中所剩薄荷油的含量，薄荷油的保留率按式（1）計(jì)算。

式中，m1——最初稱(chēng)量薄荷油納米乳液的質(zhì)量，g；m2—— 一段時(shí)間后稱(chēng)量薄荷油納米乳液的質(zhì)量，g；V1——將質(zhì)量為m1的薄荷油納米乳液蒸餾后所得油的體積，mL；V2——將質(zhì)量為m2的薄荷油納米乳液蒸餾后所得油的體積，mL。

1.3.4 薄荷油及薄荷油納米乳液的抑菌特性測(cè)定

活動(dòng)之后，我做了兩次安撫。一次是對(duì)同學(xué)們的安撫，主要是詳述解憂(yōu)雜貨店各位店員的付出和努力，以取得同學(xué)們的理解和支持；一次是對(duì)店員的安撫，畢竟是第一次，積極的肯定會(huì)讓他們更勇敢地面對(duì)自身存在的問(wèn)題。后來(lái)，店長(zhǎng)黎一鳴發(fā)來(lái)了反思總結(jié)：

1.3.4.1 抑菌液的制備 將保存在固體培養(yǎng)基上的單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌接到液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩36 h。液體培養(yǎng)基中的菌落密度約為109CFU/mL，然后用液體培養(yǎng)基將稀釋后的濃度控制在104CFU/mL 范圍內(nèi)。

1.3.4.2 最低抑菌濃度的測(cè)定 根據(jù)Hammer 等[10]的方法略做修改，通過(guò)瓊脂稀釋法將兩倍稀釋梯度濃度的對(duì)照組薄荷油和薄荷油納米乳液置于15 mL 的固體培養(yǎng)基中，使其體積分?jǐn)?shù)范圍從4%～0.0125%。移取配制好的菌液5 μL 于培養(yǎng)基表面。固體空白培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為4%不含薄荷油的納米乳液為對(duì)照。將平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.4.3 菌落生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 為進(jìn)一步測(cè)定單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌在加有最低抑菌濃度下的純薄荷油和薄荷油納米乳液的生長(zhǎng)情況，研究采用平板計(jì)數(shù)法觀(guān)察菌落總數(shù)隨時(shí)間變化的情況。分別在0，1，3，6，9，12，24，36 h 取菌液0.1 mL，通過(guò)十進(jìn)制制備稀釋液，將其涂布于固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)，繪制微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每次試驗(yàn)做3 次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin9.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳液的冷凍掃描電鏡觀(guān)察

掃描電鏡在圖像分析中起重要作用，它可以提供高分辨率的信息，其觀(guān)察效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了光學(xué)顯微鏡。本研究利用冷凍掃描電鏡（Cryo-SEM）技術(shù)，對(duì)高壓均質(zhì)制備的薄荷油納米乳液的液滴大小進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)納米乳液表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理。將樣品放置在支架并安裝在運(yùn)輸棒上后，在液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到冷凍室凍裂，再將其濺到金/鈀上。最后將樣品移至掃描電鏡室觀(guān)察液滴表面。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，采用SPI 為表面活性劑制備的薄荷油納米乳液液滴呈規(guī)則的球形且表面連續(xù)、光滑、無(wú)孔隙和裂縫。連續(xù)、致密的表面結(jié)構(gòu)一定程度上可以阻止薄荷油中的生物活性成分薄荷醇、薄荷酮在貯藏時(shí)揮發(fā)，且可以有效阻止O2透過(guò)乳滴界面與油相接觸，進(jìn)而阻止生物活性成分氧化。同時(shí)，結(jié)果表明所述納米乳液液滴均勻分布且?guī)缀鯖](méi)有可見(jiàn)的表面油脂，穩(wěn)定性?xún)?yōu)良。

圖1 薄荷油納米乳液的冷凍掃描電鏡圖像Fig.1 Microscope images of peppermint oil nanoemulsion by Cryo-scanning electron microscopy

2.2 pH 值對(duì)納米乳液穩(wěn)定性的影響

研究表明，pH 值會(huì)影響大豆分離蛋白的溶解度和乳化穩(wěn)定性，進(jìn)而影響納米乳化體系的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。研究pH 值對(duì)薄荷油納米乳液的物理穩(wěn)定性的影響十分必要。測(cè)定pH 3～10 范圍內(nèi)薄荷油納米乳液的平均粒徑、粒徑分布、濁度、ζ 電位的變化如圖2所示。結(jié)果表明，pH 值在3.0～5.0 范圍內(nèi)，隨著pH 值的增加，粒徑分布比較分散，此時(shí)薄荷油納米乳液的平均粒徑較大，且pH 4.0 時(shí)，薄荷油納米乳液的平均粒徑達(dá)到最大值1 550 nm，這是因?yàn)樵赟PI 等電點(diǎn)附近，蛋白表面電荷被中和，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥力減小，蛋白的溶解度降低，易發(fā)生液滴聚合形成較大的聚合體[11]，導(dǎo)致納米乳液的平均粒徑增大，表明酸性環(huán)境對(duì)薄荷油納米乳液的破壞作用較大。當(dāng)pH 值在6.0～10.0 范圍內(nèi)，薄荷油納米乳液的平均粒徑較小，且pH 7.0 時(shí)，薄荷油納米乳液的平均粒徑最小，這是因?yàn)榇藭r(shí)乳液pH 值遠(yuǎn)離SPI 等電點(diǎn)，乳液的蛋白表面電荷數(shù)量增加，靜電斥力變強(qiáng)，導(dǎo)致液滴聚集現(xiàn)象減弱，粒徑分布較為集中，表明堿性環(huán)境內(nèi)薄荷油納米乳液表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。蘇佳琪等[12]研究結(jié)果表明，在pH 3.0～10.0 范圍內(nèi)，納米乳液的平均粒徑隨著pH 值的增大呈先升高再降低后呈相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)，這與本文研究結(jié)果一致。薄荷油納米乳液的ζ 電位變化如下，pH 值在3.0～6.0 范圍內(nèi)，乳化體系的ζ 電位絕對(duì)值先減小后增加，主要原因在于酸性環(huán)境中隨著pH 值的增加，SPI 表面的H+離子逐漸解離，其表面電性減弱，薄荷油納米乳液的ζ 電位絕對(duì)值逐漸減小，在SPI 等電點(diǎn)附近薄荷油納米乳液的ζ 電位絕對(duì)值達(dá)到最小值，隨著pH 值的增加，此時(shí)SPI 表面暴露出更多的帶電基團(tuán)，乳液的ζ 電位絕對(duì)值逐漸增大；pH 值大于7.0 時(shí)，SPI 表面帶電基團(tuán)完全解離，乳液的ζ 電位趨于穩(wěn)定[13]。薄荷油納米乳液的濁度變化呈先增大后減小后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，結(jié)果表明，堿性環(huán)境中薄荷油納米乳液的濁度變化較小。綜上所述，以SPI-PC 為表面活性劑制備的薄荷油納米乳液具有較強(qiáng)的酸堿抵抗力，且在堿性環(huán)境下，納米乳液表現(xiàn)出良好的物理穩(wěn)定性。

圖2 pH 值對(duì)納米乳液平均粒徑、粒徑分布、ζ 電位、濁度的影響Fig.2 Effect of pH value on the average size，particle size distribution，ζ-potential and turbidity of nanoemulsion

2.3 離子強(qiáng)度對(duì)納米乳液穩(wěn)定性的影響

Na、Ca 離子對(duì)薄荷油納米乳液穩(wěn)定性的影響類(lèi)似但不完全相同，Ca 離子濃度增加對(duì)薄荷油納米乳液的平均粒徑、粒徑分布、濁度、電位的影響更大。這是由于鹽離子對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響主要由蛋白質(zhì)的疏水作用而發(fā)揮其功能，故離子價(jià)態(tài)不同，對(duì)乳液的穩(wěn)定性影響程度也不同。陳霞等[20]研究表明隨著離子價(jià)態(tài)的增大，蛋白穩(wěn)定性隨之下降；朱振寶等[21]也發(fā)現(xiàn)Ca 離子對(duì)乳液穩(wěn)定性影響明顯大于Na 離子。上述結(jié)果表明薄荷油納米乳液是具有一定抵抗鹽離子能力而存在的乳化體系。

2.4 薄荷油納米乳液貯藏穩(wěn)定性分析

2.4.1 納米乳液的物理穩(wěn)定性分析 大量研究表明，在乳液的運(yùn)輸貯藏過(guò)程中，溫度對(duì)其理化穩(wěn)定性具有顯著影響。具體表現(xiàn)為溫度升高會(huì)引起乳液奧斯特瓦爾德熟化加劇以及布朗運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而引起乳液的破乳或液滴聚合等現(xiàn)象。因此，如何構(gòu)建一種乳化體系，在乳液的保質(zhì)期內(nèi)保持良好的物理穩(wěn)定性是納米乳液應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域的重要問(wèn)題。

本研究將薄荷油納米乳液在4，25，55 ℃條件下貯藏30 d，結(jié)果如圖5所示。在3 個(gè)貯藏溫度下，薄荷油納米乳液都出現(xiàn)平均粒徑和ζ 電位增大的現(xiàn)象。在4 ℃貯藏30 d 后，乳液的平均粒徑由151.1 nm 增加到182.1 nm，在25 ℃貯藏30 d 后，薄荷油納米乳液的平均粒徑分別增大到221.3 nm。在55 ℃時(shí)，乳液的平均粒徑變化趨勢(shì)一致，增大到236.4 nm。已有研究表明，在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中溫度升高時(shí)乳液表面活性劑發(fā)生降解，從而失去活性。同時(shí)布朗運(yùn)動(dòng)加劇導(dǎo)致乳液液滴間的碰撞加劇，導(dǎo)致液滴聚合，進(jìn)而導(dǎo)致薄荷油納米乳液的粒徑增大[22]。然而薄荷油納米乳液在4，25，55 ℃條件下貯藏30 d，平均粒徑仍能保持在納米級(jí)的液滴范圍內(nèi)且未出現(xiàn)破乳或相分離現(xiàn)象，同時(shí)薄荷油納米乳液的ζ 電位均處于-35～-30 mV 之間，維持在乳液穩(wěn)定的范圍內(nèi)。上述結(jié)果表明薄荷油納米乳液在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中具有良好的物理穩(wěn)定性。

圖3 Na 離子濃度對(duì)納米乳液平均粒徑、粒徑分布、ζ 電位、濁度的影響Fig.3 Effect of Na+ concentration on average size，particle size distribution，ζ-potential and turbidity of nanoemulsion

圖4 Ca 離子濃度對(duì)納米乳液平均粒徑、粒徑分布、ζ 電位、濁度的影響Fig.4 Effect of Ca2+ concentration on average size，particle size distribution，ζ-potential and turbidity of nanoemulsion

圖5 貯藏過(guò)程中納米乳液平均粒徑和ζ 電位的變化Fig.5 Change of average size and ζ-potential of nanoemulsion during storage

圖6 薄荷油包埋率隨貯藏時(shí)間的變化Fig.6 Change of embedding rate of peppermint oil with storage time

2.4.2 納米乳液的化學(xué)穩(wěn)定性分析 將薄荷油納米乳液分別置于4，25，55 ℃下貯藏30 d，然后進(jìn)行化學(xué)穩(wěn)定性比較分析，通過(guò)測(cè)定3 個(gè)溫度下薄荷油的包埋率反映生物活性物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性[23]。如圖6所示，在薄荷油納米乳液貯藏期間，薄荷油的含量逐漸減小，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋率的下降速率逐漸減小。根據(jù)納米乳液物理穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化體系的平均粒徑增大，液滴界面面積減小，液滴與水相中自由基及促氧化劑的接觸面積減小，導(dǎo)致納米乳化體系包埋率的降低速率減小[24]。貯藏30 d 后，薄荷油在乳液中的包埋率均在85%以上，貯藏性良好。結(jié)合乳液平均粒徑與ζ 電位變化可知，納米乳化體系在高溫下促進(jìn)液滴聚合，建議將制備好的薄荷油納米乳液置于4 ℃下貯藏。

2.5 納米乳液抗菌特性的研究

本研究選用兩種典型的革蘭氏陽(yáng)性菌株單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌為檢測(cè)菌，考察薄荷油在納米乳液包埋前、后的抗菌特性變化。

2.5.1 納米乳液最小抑菌濃度測(cè)定 通過(guò)瓊脂平板稀釋法檢測(cè)了空白對(duì)照薄荷油和薄荷油納米乳液對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度，由表1所示，空白對(duì)照薄荷油對(duì)兩種菌株的最低抑菌濃度均為0.5%，表明薄荷油對(duì)兩種菌株的抑制效果一致，分析原因由于兩種菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相近，因此兩種菌株對(duì)薄荷油及薄荷油納米乳液的敏感性相近。Vuuren等[25]研究結(jié)果表明，薄荷油作為抑菌劑對(duì)微生物的抑菌效果處于中等抑制范圍，與本研究結(jié)果一致。與空白對(duì)照薄荷油的抑菌效果相比，薄荷油納米乳液的最低抑菌濃度也為0.5%，此結(jié)果表明制成納米乳液乳化體系并未改變薄荷油的抑菌能力，主要原因在于納米乳化體系會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物起到保護(hù)作用，進(jìn)一步阻止其氧化和揮發(fā)。Sharif 等[26]研究的黑孜然精油與黑孜然精油納米乳液的MIC值均為0.08%，此結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

表1 薄荷油和薄荷油納米乳液對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌抗菌特性的影響Table 1 Antimicrobial properties of peppermint oil and peppermint oil nanoemulsion againt L.monocytogenes and S.aureus

2.5.2 微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 為進(jìn)一步考察薄荷油與薄荷油納米乳液對(duì)兩種菌株生長(zhǎng)的影響，將兩種菌液同最低抑菌濃度的薄荷油與薄荷油納米乳液共同培養(yǎng)，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法考察36 h 內(nèi)對(duì)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響。如圖7所示，納米乳液對(duì)照組對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌兩種菌落均無(wú)抑菌作用。薄荷油與薄荷油納米乳液對(duì)兩種菌株的生長(zhǎng)具有抑制作用，由圖7a 可知，經(jīng)最低抑菌濃度薄荷油納米乳液處理的單增李斯特菌液，其菌落總數(shù)在第9 小時(shí)從104CFU/mL 下降到101CFU/mL，隨時(shí)間延長(zhǎng)又迅速上升，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h 后，薄荷油納米乳化體系包埋處理的菌落總數(shù)控制在103CFU/mL，而純薄荷油的菌落總數(shù)已達(dá)到107CFU/mL。比較薄荷油對(duì)金黃色葡萄球菌與單增李斯特菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)更緩慢，表明金黃色葡萄球菌對(duì)薄荷油的抑菌能力更敏感，將其在37 ℃恒溫培養(yǎng)5 h 后，發(fā)現(xiàn)菌落數(shù)從104CFU/mL 下降至101CFU/mL，將薄荷油經(jīng)納米乳化包埋后的抗菌作用時(shí)間延長(zhǎng)至24 h 左右，菌落總數(shù)才開(kāi)始回升。恒溫培養(yǎng)36 h 后，薄荷油納米乳液處理的菌落總數(shù)增長(zhǎng)控制在103CFU/mL 左右，相比之下對(duì)照組薄荷油處理的菌落總數(shù)已經(jīng)增長(zhǎng)至105CFU/mL。

上述結(jié)果表明，雖然薄荷油和薄荷油納米乳液對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度相同，然而比較兩種菌株恒溫培養(yǎng)36 h 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知，薄荷油納米乳液具有比薄荷油持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的抑菌能力。主要原因在于納米級(jí)的粒徑有利于減小乳液的傳質(zhì)阻力，一定程度上提高了兩種菌株被動(dòng)吸附薄荷油的能力，進(jìn)一步提高了薄荷油的抑菌能力，薄荷油經(jīng)納米乳化體系包埋后，其理化穩(wěn)定性與溶解度均有所提高，增大了連續(xù)相中精油生物活性成分與微生物相互作用的機(jī)率，同時(shí)在菌液培養(yǎng)過(guò)程中，納米乳液具有控制釋放的作用，不僅能夠保證薄荷油的生物活性成分免遭破壞，更可以達(dá)到延長(zhǎng)抑菌時(shí)間的效果[27]。此類(lèi)結(jié)果與Wang 等[28]的研究結(jié)果類(lèi)似。

圖7 薄荷油和薄荷油納米乳液對(duì)單增李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)Fig.7 Time-kill plots for bulk peppermint oil and peppermint oil nanoemulsions against L.monocytogenes and S.aureus

3 結(jié)論

本文研究了薄荷油納米乳液的微觀(guān)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定機(jī)制及功能特性。冷凍掃描電鏡結(jié)果表明納米乳液中薄荷油完全被SPI 包埋，呈核殼狀結(jié)構(gòu)。物理穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)薄荷油納米乳液具有良好的pH 值、離子強(qiáng)度抵抗性，堿性環(huán)境有利于薄荷油納米乳液穩(wěn)定性的保持。Na、Ca 離子對(duì)薄荷油納米乳液穩(wěn)定性的影響類(lèi)似但不完全相同，Ca 離子濃度增加對(duì)薄荷油納米乳液穩(wěn)定性的影響大于Na 離子。在4，25，55 ℃下貯藏30 d 后，乳液的粒徑增加30～50 nm，仍保持在納米級(jí)粒徑范圍內(nèi)，同時(shí)化學(xué)穩(wěn)定性結(jié)果表明3 種溫度下貯藏30 d的納米乳化體系的薄荷油保留率均高于85%，乳液無(wú)明顯分層現(xiàn)象，薄荷油納米乳液表現(xiàn)出良好的貯藏穩(wěn)定性。薄荷油納米乳液的抑菌特性結(jié)果顯示薄荷油納米乳液對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.5%，此結(jié)果與對(duì)照組薄荷油的抑菌效果相一致，然而從兩種微生物在36 h 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果可知，薄荷油納米乳液具有時(shí)效更長(zhǎng)的抑菌特性。