1株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、毒素基因檢測、分型及藥敏試驗(yàn)

劉 洋 ， 龍 劍 ， 梁 婭 ， 廖華媛 ， 李潤成

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 湖南 長沙 410128)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是一種由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的烈性傳染性呼吸道疾病，其死亡率極高，主要臨床癥狀表現(xiàn)為出血性纖維素性肺炎和壞死性纖維素性肺炎[1]。隨著我國集約化養(yǎng)豬業(yè)的急速發(fā)展以及區(qū)域之間的頻繁引種，該病在我國的流行趨勢日漸上升，現(xiàn)已成為我國豬群主要的細(xì)菌性呼吸道傳染病之一，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

APP有2種分型方式，第1種以其生長時(shí)是否依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)為條件分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，其中生物Ⅰ型生長需要NAD，生物Ⅱ型生長不依賴NAD[2]。根據(jù)APP脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)的差異又可以將其分為18種血清型，其中血清型16型、17型和18型在2015-2018年才被發(fā)現(xiàn)[3-7]。

傳染性胸膜肺炎放線桿菌的侵襲力和持久性與眾多毒力因子相關(guān)，Apx毒素是其主要的毒力因子之一。Apx毒素包括Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV，其中Apx I具有很強(qiáng)的溶血性和細(xì)胞毒性，其能誘導(dǎo)豬的肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡；Apx II的溶血性和細(xì)胞毒性相對較弱；Apx III無溶血性但具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其能對外周單核細(xì)胞造成巨大的損傷；Apx IV雖然毒性較小，但APP的所有血清型都含有該基因，可以將其視為鑒定APP菌株的特異性基因[2,8-9]。

2018年12月，浙江慈溪某規(guī)?；i場部分肥豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、咳嗽等癥狀，對死亡豬只進(jìn)行剖檢，其主要病理變化為纖維素性肺炎、心包炎和胸腔積液，見封三彩版圖1、2，疑似APP感染。取病死豬的肺臟進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、毒力基因檢測、血清型鑒定、生物型鑒定及藥敏試驗(yàn)，報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料 2018年12月，病料采集于浙江慈溪某規(guī)?；i場病死豬的肺臟。

1.2 培養(yǎng)基 TSB培養(yǎng)基，購自O(shè)XOID公司；巧克力平板，購自貝瑞特公司；血瓊脂平板，購自江門公司。

1.3 試劑 小牛血清，購自益康生物公司；革蘭染色試劑及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，均購自北京索萊寶科技有限公司；即用型PCR試劑盒3.0(Mix)，購自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；2 000 DNA Marker及Super DNA Marker，均購自北京康為世紀(jì)公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離及革蘭染色鏡檢 用無菌接種環(huán)鉤取病死豬的肺臟接種于巧克力平板上，將巧克力平板置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，次日觀察菌落的大小及形態(tài)，從中挑取單菌落純化并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

2.2 16S rDNA PCR檢測 參照文獻(xiàn)[10]中的方法合成細(xì)菌16S rDNA通用引物。以分離菌株為模板，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min; 變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán); 再延伸72 ℃ 7 min。PCR體系：Mix 25 μL，純水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL,模板1 μL。將PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3Apx毒素的鑒定 按照廖華媛等[11]的方法合成Apx毒素基因檢測引物。以分離菌株為模板，用4對毒素基因檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，ApxI退火65 ℃，ApxII退火63 ℃，ApxIII及ApxIV退火61 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 7 min。PCR體系：Mix 25 μL，純水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL。

2.4 血清型及生物型分型 將分離菌株接種于涂有NAD的血瓊脂平板及未涂NAD的血瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，次日觀察細(xì)菌是否生長，若分離菌株的生長需要依賴NAD，則說明其為生物Ⅰ型，若分離菌株的生長不依賴NAD，則說明其為生物Ⅱ型[2]。按照Bossé等[12]的方法合成血清型鑒定引物，對該菌株進(jìn)行血清型鑒定，PCR方法按常規(guī)進(jìn)行。

2.5 藥敏試驗(yàn) 使用K-B法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種至含10%小牛血清及1‰NAD的TSB培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)好的細(xì)菌用無菌水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，吸?00 μL稀釋菌液用涂布器均勻涂于巧克力平板上，待液體吸干后將藥敏試紙片輕輕貼在巧克力平板上，于37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，次日記錄抑菌環(huán)的直徑并根據(jù)其結(jié)果判斷分離菌株對不同藥物的敏感程度。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離 用無菌接種環(huán)鉤取病死豬的肺臟接種于含NAD的巧克力平板上，并從中挑取單菌落進(jìn)行純化。在巧克力平板中長出了直徑為1～3 mm、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的灰白半透明菌落。見封三彩版圖3。

3.2 革蘭染色鏡檢 從純化過的巧克力平板中挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，在顯微鏡中看到了大量革蘭陰性桿菌，多散發(fā)呈桿狀，也有短鏈狀。其大小和形態(tài)與傳染性胸膜肺炎放線桿菌極其相似，革蘭染色鏡檢見封三彩版圖4。

3.3 16S rDNA PCR檢測 以分離菌株為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增到了與預(yù)期大小相符的特異性條帶，見圖5。將PCR產(chǎn)物送至長沙擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的APP基因序列的同源性為99%，確定該分離菌株為APP。

圖5 16S rDNA PCR結(jié)果

3.4Apx毒素的鑒定結(jié)果 對分離菌株進(jìn)行Apx4種毒素的PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示該菌株含有ApxII(358 bp)、ApxIII(320 bp)、ApxIV(634 bp)3種毒素基因。DNA電泳圖見圖6。

圖6 Apx毒素基因鑒定結(jié)果

3.5 生物型及血清型鑒定 將分離菌株涂板于含NAD的血瓊脂平板及不含NAD的血瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，次日發(fā)現(xiàn)含NAD的血瓊脂平板上有菌落生長且伴隨有溶血現(xiàn)象，而不含NAD的血瓊脂平板上無菌落生長，說明分離菌株在生長過程中需要依賴NAD，其屬于生物Ⅰ型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8,13-14]，能同時(shí)產(chǎn)生Apx II、Apx III、Apx IV 3種毒素的APP血清型只有2、3、4、6、8型及15型，參照文獻(xiàn)[12]合成了2、3、4、6、8型及15型血清型鑒定引物并對分離菌株進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果顯示，該菌株為APP 15型菌株。將PCR產(chǎn)物送至長沙擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示該序列與GenBank中APP 15型基因序列的同源性為99%，確定分離菌株的血清型為15型。APP 2、3、4、6、8、15型血清型PCR鑒定結(jié)果見圖7。

圖7 APP 2、3、4、6、8、15型血清型鑒定結(jié)果

3.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢曲松、恩諾沙星、氨芐西林及復(fù)方新諾明4種藥物較為敏感，對鏈霉素有較強(qiáng)的耐藥性。見表1。

表1 分離菌株部分藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

本試驗(yàn)從浙江慈溪某豬場病死豬的肺臟中分離到了1株細(xì)菌，其形態(tài)大小與APP相似，經(jīng)16S rDNA PCR鑒定后，確定該菌株為APP菌株。后對其進(jìn)行了4種Apx毒素基因的檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株同時(shí)含有ApxII、ApxIII和ApxIV 3種毒素基因。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有ApxII、ApxIII和ApxIV毒素基因的APP血清型可能為2、3、4、6、8型或者15型，利用上述6種血清型的鑒定引物對分離菌株進(jìn)行了PCR鑒定，最終確定其為APP 15型菌株。在培養(yǎng)細(xì)菌的過程中，發(fā)現(xiàn)該菌株需要依賴NAD才能生長，根據(jù)這一特性，最終確定其為生物Ⅰ型APP菌株。用12種常用抗生素對其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢曲松、恩諾沙星、氨芐西林及復(fù)方新諾明4種藥物較為敏感，對鏈霉素具有較強(qiáng)的耐藥性。

豬傳染性胸膜肺炎的病理變化主要表現(xiàn)為肺部出血、壞死性支氣管肺炎、纖維素性胸膜炎和胸腔積液等，具有較高的致死性，近年來，此病在我國多處地方暴發(fā)，給我國畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此PCP的防控顯得十分重要，現(xiàn)今疫苗防控和藥物防控是預(yù)防PCP的主要途徑。目前國內(nèi)市場上針對PCP的疫苗主要為滅活疫苗，PCP滅活疫苗在臨床上的應(yīng)用并不普遍， 即使PCP發(fā)病嚴(yán)重的豬場對疫苗的選擇也多舉棋不定，再加上臨床生產(chǎn)實(shí)踐中抗生素的濫用，APP的耐藥性問題也越來越嚴(yán)重，這給本病的防控增加了難度。廣大的養(yǎng)殖戶可以了解當(dāng)?shù)鼐甑牧餍星闆r及血清型，從而制備合適的血清型疫苗進(jìn)行免疫接種，并且將當(dāng)?shù)亓餍兄甑哪退幥闆r了解清楚，選擇合適的藥物防治該病。