非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法綜述

樊曉旭 ， 趙 明 ， 趙永剛 ， 張志誠 ， 吳曉東 ， 王志亮

(1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 ， 山東 青島 266032 ； 2. 青島市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 山東 青島 266100)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家豬和野豬(如歐亞野豬)引起的一種急性、熱性、烈性傳染病。該病致死率高達(dá)100%。一旦暴發(fā)，往往給受災(zāi)國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成不可估量的損失和影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。自 1921 年首次報(bào)道以來，非洲豬瘟從非洲傳播至歐洲、南美洲、亞洲等的多個(gè)國(guó)家。近一年來，非洲豬瘟病毒傳播速度明顯加快，呈現(xiàn)愈演愈烈之勢(shì)。據(jù)OIE 通報(bào)數(shù)據(jù)顯示，2019年1-12月期間，曾暴發(fā)或者正在暴發(fā)非洲豬瘟疫情的國(guó)家有28個(gè),包含歐洲國(guó)家13 個(gè)、亞洲國(guó)家12個(gè)和非洲國(guó)家3 個(gè)，其中亞洲幾個(gè)國(guó)家的疫情尤為嚴(yán)重。由于至今依然缺乏公認(rèn)安全有效的疫苗和藥物用于預(yù)防、控制和治療非洲豬瘟，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早處置、提高生物安全管理水平是目前非洲豬瘟防控的主要措施。其中，準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)于非洲豬瘟的防控至關(guān)重要。

本文檢索了美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫1960-2019年收錄的有關(guān)非洲豬瘟診斷方法方面的試驗(yàn)性文章，選取的關(guān)鍵詞為“African swine fever”，同時(shí)包含“diagnosis”或“detection”，排除綜述類、非診斷研究類文章，共納入文章103篇。其中，病原學(xué)檢測(cè)方法72篇，血清學(xué)檢測(cè)方法31篇。20世紀(jì)60年代10篇、70年代12篇、80年代12篇、90年代19篇、21世紀(jì)00年代17篇、10年代33篇。從發(fā)表文章數(shù)量可以看出，非洲豬瘟檢測(cè)相關(guān)文章總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，特別是在最近10年，文章數(shù)量明顯上升(見中插彩版圖1)。非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷方法按照時(shí)間可大致劃分為3個(gè)階段：20世紀(jì)60-70年代，主要利用病毒本身特性，例如血吸附性、感染致細(xì)胞病變(CPE)，以及抗原抗體特異性結(jié)合原理，輔以瓊脂擴(kuò)散、沉淀、放射性擴(kuò)散、電泳、熒光素標(biāo)記等手段，對(duì)ASF病原及抗體進(jìn)行檢測(cè)。20世紀(jì)80-90年代，一方面，ELISA、免疫印跡方法進(jìn)一步發(fā)展，逐漸成為主流的血清學(xué)檢測(cè)方法；另一方面，除了建立直觀顯微觀察CPE和夾心ELISA方法外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子雜交和PCR技術(shù)也逐步應(yīng)用到ASFV病原學(xué)檢測(cè)中。21世紀(jì)最初20年，普通PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)以及各種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展，檢測(cè)的靈敏性得到顯著提高。通過化學(xué)發(fā)光、免疫微球和膠體金技術(shù)，使基于抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的診斷技術(shù)操作更加便捷。多重PCR、微陣列和液相芯片技術(shù)，使同一時(shí)間檢測(cè)多種病原成為可能。本文以時(shí)間為主線，回顧非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的發(fā)展歷程，以期為非洲豬瘟的診斷乃至防控提供參考。

1 20世紀(jì)60-70年代

1960年，Malmquist和IHay發(fā)現(xiàn)正常的豬紅細(xì)胞會(huì)吸附在感染非洲豬瘟病毒的細(xì)胞表面，且大多數(shù)ASFV分離株都會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象。從NCBI數(shù)據(jù)庫中可查，1965年，前蘇聯(lián)科學(xué)家報(bào)道了通過紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD)鑒定非洲豬瘟病毒[1]。盡管并不是所有的非洲豬瘟病毒都具有血吸附特性，但該方法迄今依然是鑒定病毒、測(cè)定病毒含量(HAD50)的重要手段。非洲豬瘟病毒在原代豬腎細(xì)胞中傳代，盡管病毒毒力發(fā)生一定變化，但紅細(xì)胞吸附能力依然保留。1966-1967年，法國(guó)Boulanger等利用當(dāng)時(shí)流行的試驗(yàn)技術(shù)，報(bào)道了各種非洲豬瘟病毒的檢測(cè)方法[2]。例如，利用改良的直接補(bǔ)體固定試驗(yàn)或瓊脂凝膠雙擴(kuò)散技術(shù)，可成功檢測(cè)到病豬脾臟和肝臟中的病毒抗原。將異硫氰酸熒光素與血清偶聯(lián)建立免疫熒光檢測(cè)病毒抗原的方法，能夠檢測(cè)到冷凍組織切片、血涂片和培養(yǎng)細(xì)胞物中病毒抗原，不受豬體中抗體的干擾。同時(shí)，利用不同顏色的熒光素偶聯(lián)，能夠區(qū)分非洲豬瘟和古典豬瘟病毒(CSFV)抗原，也是最早報(bào)道的非洲豬瘟與其他病原的實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷方法[3]。而經(jīng)過不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，直接免疫熒光法(FAT)目前仍是直觀觀測(cè)非洲豬瘟病毒在組織細(xì)胞中分布的重要手段。

在20世紀(jì)70年代，涌現(xiàn)出多種ASF抗體檢測(cè)方法。免疫電滲電泳方法被應(yīng)用于ASF特異性抗體的檢測(cè)，反應(yīng)僅耗時(shí)30 min。此外，西班牙實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了高丙種球蛋白血癥與碘凝集試驗(yàn)、反向單向放射免疫擴(kuò)散等方法用于檢測(cè)血清中的抗體。間接免疫熒光和微型血清樣品承載波片用于大規(guī)模的抗體監(jiān)測(cè)工作[4]。1979年，人們開發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗原和抗體的固相放射免疫分析方法(RIA)，可最低檢測(cè)到相當(dāng)于50～500 HAD50/mL的抗原濃度。這種直接或間接抗體RIA，比現(xiàn)有的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)靈敏約100倍，比免疫電滲電泳抗體檢測(cè)方法敏感1 000倍，且方法的重復(fù)性良好[5]。隨著酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的發(fā)明，在1979年，文章首次報(bào)道了ELISA在ASF檢測(cè)中的應(yīng)用。Wardley等對(duì)ELISA方法進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià)，證實(shí)該方法最低能夠檢測(cè)到50～500 HAD50/mL抗原，且比目前ASF抗體檢測(cè)方法更為靈敏[6]。進(jìn)而，《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》中也對(duì)該方法進(jìn)行了描述，認(rèn)為ELISA可分別用于血清和組織液中抗體及抗原的檢測(cè)。

2 20世紀(jì)80-90年代

到了20世紀(jì)80年代，一方面，科學(xué)家們對(duì)現(xiàn)有的ELISA、RIA方法進(jìn)一步做了臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)和改進(jìn)；另一方面，一些新技術(shù)也逐漸應(yīng)用到ASF檢測(cè)中。例如，簡(jiǎn)化了免疫電滲電泳檢測(cè)方法，并開發(fā)了間接免疫過氧化物酶斑點(diǎn)染色法(IPT)用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗體。在敏感性和特異性方面，該方法與間接免疫熒光法相當(dāng)，可用于抗體監(jiān)測(cè)及確診。1987年，荷蘭Knudsen等開發(fā)了豬單核白細(xì)胞(MNL)微培養(yǎng)測(cè)定ASFV含量的方法。通過倒置顯微鏡放大40倍，觀察ASFV感染單核細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。感染單核細(xì)胞開始分離、擴(kuò)大和變圓，逐漸形成葡萄狀的3～20個(gè)或更多的細(xì)胞團(tuán)，最終裂解。值得注意的是，強(qiáng)毒株、中等毒力毒株、Vero細(xì)胞適應(yīng)株和無紅細(xì)胞吸附特性毒株都可產(chǎn)生特征性CPE。這種細(xì)胞病變微量測(cè)定法(TCID)的靈敏度和重復(fù)性與HAD法相近[7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)，也相應(yīng)開發(fā)制備了多種檢測(cè)材料。例如，針對(duì)非洲豬瘟病毒14、32、73、174 kDa和240 kDa蛋白制備了一系列單克隆抗體，可應(yīng)用到免疫電子顯微鏡觀察和放射免疫分析中。荷蘭科學(xué)家利用抗IgG和IgM混合單抗建立的同種型特異性免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)方法，其敏感性高于ELISA，可用于血清學(xué)篩查[8]。奧地利實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了含有非洲豬瘟病毒西班牙70株H-ClaI基因片段(5.6 kbp)的pRPEL2重組質(zhì)粒，采取磷32標(biāo)記雜交探針，開發(fā)了DNA-DNA雜交方法。利用硝酸纖維素紙固定ASFV DNA，最低檢出限達(dá)20 pg。相比之下，非放射性磺化DNA探針的靈敏度約為4 ng，生物素化DNA探針的靈敏度約為400 pg[9]。20世紀(jì)80年代末，建立了采用免疫印跡法檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗體，并進(jìn)一步研究確定了檢測(cè)方法的干擾因素、電轉(zhuǎn)及免疫反應(yīng)條件、膜材料，證實(shí)病毒p30蛋白敏感性最佳[10]。

1990年，西班牙利用臨床血清樣品，對(duì)放射免疫沉淀法(RIPA)、免疫印跡和ELISA進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法的敏感性相當(dāng)，RIPA和ELISA方法較免疫印跡更早檢測(cè)到ASF抗體陽性[11-12]。在比較了感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可溶性部分(CS-P)和半純化病毒結(jié)構(gòu)蛋白p72作為抗原建立的2種ELISA抗體檢測(cè)法后，發(fā)現(xiàn)豬血清CS-P在感染豬的早期血清學(xué)檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。此外，在硝酸纖維素條上結(jié)合CS-P，建立簡(jiǎn)易斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)方法(DIA)，便于ASF抗體的檢測(cè)。在一項(xiàng)ASFV病原檢測(cè)比較研究中發(fā)現(xiàn)，夾心ELISA方法的檢測(cè)限為2.3×102HAD50，免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)限為4.6×102HAD50，放射性DNA探針分子雜交檢測(cè)限約為1.8×103HAD50[11]。夾心ELISA方法在檢測(cè)人工感染ASFV后8 d之內(nèi)的樣本，出現(xiàn)了一部分假陰性結(jié)果，而在接毒后9～14 d，采集的樣本均呈陽性。與病毒分離相比，ELISA方法需要的專業(yè)設(shè)施更少，檢測(cè)耗時(shí)更短。但是，在ASF亞急性感染過程中形成了病毒抗體免疫復(fù)合物，導(dǎo)致免疫學(xué)方法出現(xiàn)漏檢情況，提示分子雜交方法檢測(cè)病毒DNA更有效。

1992年，西班牙Fernandez等首次報(bào)道了利用免疫組織學(xué)切片方法檢測(cè)研究ASFV抗原，通過戊二醛固定含病毒組織，石蠟包埋，多克隆抗體檢測(cè)，可觀察組織超微結(jié)構(gòu)中的病毒分布[13]。通過對(duì)不同地區(qū)、不同年份分離到的不同ASF野毒株的基因序列比較分析，發(fā)現(xiàn)編碼ASF病毒蛋白p54和p30的基因E183L和CP204L高度保守。為了避免在生產(chǎn)過程中使用活病毒，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，改進(jìn)了Western Blot檢測(cè)方法。臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示，p54可作為Western Blot檢測(cè)ASF抗體的首選抗原，而p30更適于ELISA方法檢測(cè)抗體的候選抗原，特別是病毒感染早期的抗體檢測(cè)[14]。ASFV p72蛋白在世界各地分離的毒株中高度保守(97.8%～100%的氨基酸序列同源性)，利用抗p72的單克隆抗體建立的夾心ELISA，對(duì)p72抗原檢測(cè)限為0.05 μg/mL，低于多克隆抗體的0.6 μg/mL檢測(cè)限，可檢測(cè)2.3×102PFU/mL全病毒粒子[15]。

在非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷中，具有跨時(shí)代意義的標(biāo)志是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)于1992年首次應(yīng)用到ASFV檢測(cè)中，瑞典Steiger等針對(duì)病毒基因組保守區(qū)640 bp片段設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，成功檢測(cè)到病毒感染的組織、全血及細(xì)胞培養(yǎng)物，之后采用巢式PCR和生物素化寡核苷酸探針雜交對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證[16]。此外比較發(fā)現(xiàn)，PCR方法比HAD方法更快速、更靈敏，同時(shí)可采用病毒DNA克隆作為陽性對(duì)照，代替以往HAD方法的活病毒對(duì)照，在檢測(cè)操作過程中更加安全。

3 21世紀(jì)最初20年

進(jìn)入21世紀(jì)，基于PCR原理的ASFV診斷方法得到長(zhǎng)足發(fā)展。特別是在馬達(dá)加斯加臨床分離到的ASFV毒株，在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變或血液吸附作用，提示PCR和核苷酸測(cè)序方法在診斷中的必要性。為了避免由于反應(yīng)過程本身出現(xiàn)問題導(dǎo)致樣品檢測(cè)出現(xiàn)假陰性，法國(guó)Gonzague等及英國(guó)King等分別在普通PCR方法和TaqMan熒光定量PCR方法中設(shè)置了內(nèi)控品[17-18]。比利時(shí)Tignon等建立了含有豬肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參的熒光定量PCR方法，經(jīng)不同參考實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，檢測(cè)限為5.7～57個(gè)基因組拷貝[19]。2013年, Fernandez-Pinero等針對(duì)ASFV p72片段設(shè)計(jì)了通用探針(UPL)，并附有β-actin作為內(nèi)參質(zhì)控，通過檢測(cè)分屬19個(gè)基因型的臨床樣本，驗(yàn)證其適用性，結(jié)果顯示，比OIE推薦的TaqMan法靈敏性更高，具有良好的重復(fù)性和可靠性，目前得到多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用[20]。TaqMan熒光定量PCR方法靈敏性高，可在試驗(yàn)感染豬發(fā)病前2～4 d在扁桃體刮片樣本中檢測(cè)到病毒核酸，檢測(cè)時(shí)間不超過2 h。在靈敏性提升方面，Bastos等進(jìn)一步利用巢式PCR技術(shù)，結(jié)合內(nèi)控品，提高了靈敏性，可用于檢測(cè)軟蜱樣品中微量的ASFV核酸[21]。英國(guó)McKillen等開發(fā)了針對(duì)ASFV 9GL基因的5′小溝結(jié)合(MGB)探針熒光定量PCR方法，探針設(shè)計(jì)長(zhǎng)度更短，提高了探針設(shè)計(jì)的靈活性；探針包括一個(gè)不發(fā)光的猝滅基團(tuán)(NFQ)，極大消除傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提高了檢驗(yàn)靈敏度，檢測(cè)限達(dá)20個(gè)基因組拷貝，較OIE推薦的PCR方法靈敏10倍[22]。Ronish等開發(fā)了指數(shù)后線性PCR(LATE PCR)，并含有內(nèi)控DNA，能夠直接擴(kuò)增大量單鏈DNA，并在擴(kuò)增后讀取熒光信號(hào)，檢測(cè)限為1～10個(gè)基因組拷貝，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)約為1 h，適于實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)快速診斷[23]。利用凍干技術(shù)，將熒光定量PCR酶制成粉末，在運(yùn)輸和保存中，可進(jìn)一步確保反應(yīng)效果。2017年，中國(guó)Luo等對(duì)普通PCR方法進(jìn)行了優(yōu)化，分析檢出限達(dá)60拷貝[24]。2018年，中國(guó)Wu等建立了ASFV微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)方法，檢測(cè)限為10拷貝/反應(yīng)[25]。

南非Bastos等建立了一種基于PCR的測(cè)序方法，擴(kuò)增與p72基因C末端478 bp片段，除了確認(rèn)病毒的存在，還通過核苷酸序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步鑒定毒株遺傳特征，確定其基因型，便于后續(xù)的ASF分子流行病學(xué)研究。該方法至今依然是主要的ASFV基因分型方法，根據(jù)此方法，目前全世界非洲豬瘟病毒可分為24個(gè)基因型[26]。瑞典Leblanc等利用液相芯片方法，根據(jù)p72基因C末端的序列變異確定的基因型分類標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為15 bp或17 bp的互補(bǔ)配對(duì)DNA探針，保留了中心位置的單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異。共設(shè)計(jì)了52個(gè)探針，24個(gè)SNP對(duì)，4個(gè)通用檢測(cè)探針[27]。使用xMAP技術(shù)，探針與微球共價(jià)連接，與PCR產(chǎn)物雜交，分析儀中讀取結(jié)果。通過檢測(cè)不同基因型臨床樣品發(fā)現(xiàn)，該方法能夠檢測(cè)和區(qū)分當(dāng)時(shí)所有22個(gè)基因型。上述基因分型為確定毒株的地理分布提供了幫助和參考。2019年，美國(guó)梅島動(dòng)物疫病中心利用牛津納米孔微子序列傳感裝置作為快速測(cè)序工具，結(jié)合的新軟件腳本，開發(fā)了非洲豬瘟快速分析測(cè)序軟件工具(ASF-Fast)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)分析輸出數(shù)據(jù)。通過去除提取核酸中宿主甲基化DNA，對(duì)血液樣本和細(xì)胞培養(yǎng)分離物中的ASFV基因組序列，6 min內(nèi)可檢測(cè)到ASFV的特異性標(biāo)記。在10 min內(nèi)確保得到足夠的序列用于全基因組分析[28]。

為了滿足現(xiàn)場(chǎng)診斷需要，英國(guó)Hjertner等開發(fā)了一種Invader等溫?cái)U(kuò)增方法，不依賴昂貴精密的PCR儀器，但是，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，需要在63 ℃下孵育12 h，每20 min收集熒光信號(hào)，且靈敏性不如PCR方法，檢測(cè)限為2 500個(gè)基因組拷貝[29]。英國(guó)King團(tuán)隊(duì)以ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因?yàn)榘悬c(diǎn)，建立了ASF環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法。分析靈敏度至少為330個(gè)基因組拷貝，與熒光定量PCR法有很好的一致性，有望應(yīng)用在現(xiàn)場(chǎng)快速診斷[30]。波蘭科學(xué)家開發(fā)了交叉啟動(dòng)擴(kuò)增(CPA)，該方法可在水浴56 ℃啟動(dòng)反應(yīng)，耗時(shí)45 min，最低檢測(cè)限達(dá)720拷貝/反應(yīng)[31]。相類似的是該國(guó)科學(xué)家又開發(fā)了聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)，反應(yīng)耗時(shí)與檢出限與CPA相當(dāng)，可利用SYBR Green I熒光染料顏色變化或電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[32]。通過對(duì)LAMP和CPA進(jìn)行臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其靈敏度分別達(dá)90%和70%。目前適用于ASF的初步診斷，但仍需進(jìn)一步改進(jìn)以提高其診斷的敏感性。中國(guó)、西班牙、瑞典科學(xué)家聯(lián)合開發(fā)了ASFV和CSFV雙重實(shí)時(shí)PCR方法(稱為“T-COR4分析”)，擴(kuò)增反應(yīng)可在一個(gè)便攜式、電池驅(qū)動(dòng)的PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，從樣品處理到讀取結(jié)果共需3 h[33]。2017年，中國(guó)Wang等基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，建立了一種快速、特異的ASFV檢測(cè)方法。采用Genie-III掃描儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。利用含有ASFVp72片段的重組質(zhì)粒作為模板，在10 min內(nèi)即可檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)限為100 拷貝/反應(yīng)，靈敏度與熒光定量PCR相當(dāng)[34]。中國(guó)Miao等建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)聯(lián)合側(cè)流檢測(cè)試紙條(LFD)快速檢測(cè)方法，在38 ℃條件下，檢測(cè)限為100 拷貝/反應(yīng)，與熒光定量PCR的陽性率符合率為100%[35]。2018年，意大利Biagetti等建立了一種基于生物傳感器的嵌合DNA/LNA方法檢測(cè)豬血液中ASFV DNA。該生物傳感器包含鎖核酸單鏈DNA探針，可識(shí)別ASFVp72基因保守區(qū)，并用qPCR定量方法對(duì)該生物傳感器進(jìn)行了校準(zhǔn)，檢測(cè)限達(dá)178拷貝/μL，其中，該方法生物素和探針固定需要60 min，之后每個(gè)樣本檢測(cè)僅需5 min。對(duì)ASFV的檢出限達(dá)10拷貝/μL，一次最多檢測(cè)40個(gè)樣品[36]。Ye等開發(fā)的便攜式微流控環(huán)形熒光探針介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增(CFPA)系統(tǒng)，所需閾值時(shí)間中位數(shù)為10.8 min，檢測(cè)限為10拷貝/μL，穩(wěn)定性良好(CV<5%)，臨床樣品檢測(cè)顯示靈敏度為92.73%，特異性為100%[37]。

在基于PCR原理的多重鑒別診斷方法中，西班牙Aguero等建立并驗(yàn)證了多重RT-PCR方法，可同時(shí)鑒別診斷ASFV和CSFV。開發(fā)的多重PCR方法檢測(cè)對(duì)5種病毒CSFV、ASFV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)基因，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)方法的高通量，但是其靈敏性受到影響，檢測(cè)限較單重PCR方法升高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[38]。英國(guó)Haines等建立了同時(shí)檢測(cè)ASFV、CSFV、外源性RNA內(nèi)控的三重?zé)晒舛縋CR方法，對(duì)ASFV和CSFV的檢測(cè)限分別為22個(gè)和5個(gè)基因組拷貝，臨床樣品驗(yàn)證顯示方法的靈敏性和特異性與標(biāo)準(zhǔn)的普通PCR方法相當(dāng)，滿足臨床對(duì)2種豬病的鑒別需求[39]。我國(guó)科學(xué)家建立的多重PCR方法，對(duì)CSFV、ASFV、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)、PRRSV和偽狂犬病病毒(PRV)的最低檢測(cè)限分別為1.09×104、1.50×103、2.10×103、1.30×103拷貝/反應(yīng)和8.97×102拷貝/反應(yīng)。此外，基于GeXP基因表達(dá)譜儀，進(jìn)一步建立了一種同時(shí)檢測(cè)和鑒別7種豬病原的高通量方法。包括PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、PPV、PCV-2和日本腦炎病毒(JEV)，對(duì)每個(gè)病原的靈敏性達(dá)1 000拷貝/反應(yīng)[40]。同樣，通過建立上述7種病原多重PCR，將PCR產(chǎn)物雜交成微球與探針偶聯(lián)，再用Bio-Plex懸浮陣列系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，檢出限與基于GeXP基因表達(dá)譜儀方法相當(dāng)。將RT-PCR與自動(dòng)電子微陣列技術(shù)結(jié)合，自動(dòng)完成探針捕獲、雜交，清洗和報(bào)告，可同時(shí)檢測(cè)豬的7種重要病毒：口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)，豬水皰性疹病毒(VESV)、ASFV、CSFV、PRRSV和PCV-2，其中，對(duì)ASFV的檢出限達(dá)10拷貝/μL。利用xMAP液相芯片技術(shù)，將探針與熒光羧化微球偶聯(lián)，同時(shí)檢測(cè)藍(lán)舌病病毒、鹿的流行性出血熱病毒、非洲豬瘟病毒、西尼羅河熱病毒等10種蟲媒病毒目的基因，靈敏性達(dá)10拷貝/μL[41]。2019年，加拿大開發(fā)了多重檢測(cè)工作站，包括了CSFV、ASFV、SVDV、FMDV、水泡性口炎病毒(VSV)，用戶只需添加樣品和試劑，從核酸提取、多重RT-PCR、反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)到結(jié)果報(bào)告，完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。整個(gè)過程耗時(shí)約6 h，可同時(shí)處理24個(gè)不同組織類型的樣品[42]。

在抗體檢測(cè)方面，俄羅斯通過將ASFV基因CP204L(p30)的中心親水區(qū)克隆到原核載體中，表達(dá)高純度重組p30，診斷特異性為98.75%，敏感性為100.00%。在感染后6～8 d內(nèi)，可從家豬和野豬采集的免疫系統(tǒng)器官和血清樣本中檢測(cè)到ASFV特異性抗體[43]。在大規(guī)?？贵w監(jiān)測(cè)方面，由于血清樣品腐敗變質(zhì)，常導(dǎo)致基于p30、p54蛋白建立的ELISA方法結(jié)果出現(xiàn)假陽性，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)pp62蛋白，建立ELISA方法，提高了檢測(cè)腐敗血清樣品的準(zhǔn)確性，其原因推測(cè)是pp62比p30、p54更大、抗原表位更多，表現(xiàn)的抗原性更強(qiáng)[44]。此外，推薦pB602L和pK205R蛋白表達(dá)也可用于ELISA方法檢測(cè)ASF抗體。Aira等利用液相芯片技術(shù)，將ASFV p72和p30蛋白，以及CSFV的E2蛋白分別與微球偶聯(lián)，相應(yīng)與市售的抗ASFV或CSFV抗體ELISA試劑盒做比較，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)ASFV抗體的靈敏度為97.3%，特異性為98.3%，檢測(cè)CSFV抗體的靈敏度為95.7%，特異性為99.8%。這種雙重檢測(cè)方法可以同時(shí)區(qū)分抗ASFV和CSFV的抗體，為監(jiān)測(cè)研究提供了有價(jià)值的工具，并有助于與ASF和CSF鑒別診斷[45]?；贏SFV p72蛋白，西班牙INGENASA實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了用于抗原檢測(cè)的橫向流動(dòng)分析法(LFA)。盡管不如PCR方法敏感，但檢測(cè)臨床樣品發(fā)現(xiàn)，LFA與ELISA相關(guān)性良好，且敏感性高于ELISA，檢測(cè)限達(dá)104HAU。基于此，還進(jìn)一步開發(fā)了能夠同時(shí)鑒別診斷ASFV和CSFV的雙重LFA[46]。2015年，歐盟利用785份臨床和試驗(yàn)樣本對(duì)現(xiàn)有的非洲豬瘟診斷方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，相比OIE推薦的King等方法，UPL-PCR敏感性更高，在早期檢測(cè)和對(duì)感染康復(fù)的豬樣本檢測(cè)方面更具優(yōu)勢(shì)。間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IPT)比ELISAs更敏感，能夠在血清學(xué)反應(yīng)的早期檢測(cè)到ASF抗體。推薦UPL-PCR結(jié)合IPT，用于ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷[47]。

4 思考與展望

自非洲豬瘟2007年傳入高加索地區(qū)格魯吉亞，并向歐洲、亞洲蔓延，2010年后，發(fā)表的有關(guān)非洲豬瘟診斷方法的文章數(shù)量也明顯增多，從這個(gè)角度也反映出非洲豬瘟的全球關(guān)注度持續(xù)升高?？煽康脑\斷方法在當(dāng)前非洲豬瘟防控和國(guó)際貿(mào)易中發(fā)揮著重要作用。可以看到，非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷新方法的出現(xiàn)，離不開理化技術(shù)的發(fā)展、新型儀器設(shè)備的開發(fā)。與此同時(shí)，雖然一些方法，如HAD、FAT、ELISA、IPT、IB，早在20世紀(jì)60-90年代就已問世，經(jīng)過了長(zhǎng)期的應(yīng)用和檢驗(yàn)，《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》仍將其列為不同情形目的下推薦的診斷方法(表1)。而值得注意的是，手冊(cè)中顯示，至今沒有任何一種方法可以適用于評(píng)價(jià)個(gè)體或群體疫苗接種后的免疫狀態(tài)[48]。

表1 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法特征

我國(guó)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)戶中99%以上是中小散養(yǎng)戶，防疫意識(shí)普遍不強(qiáng)，生物安全水平不高，應(yīng)對(duì)非洲豬瘟防范能力較差，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并初步判斷病情、采取有效控制措施。在未來，需要我們進(jìn)一步開發(fā)、驗(yàn)證、評(píng)價(jià)、快速的檢測(cè)方法，來滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。同時(shí)，在確保方法快速、特異、靈敏的前提下，可開發(fā)多個(gè)病原的高通量檢測(cè)方法，更好的滿足未來養(yǎng)殖、檢疫等領(lǐng)域需求。此外，在養(yǎng)殖場(chǎng)日常監(jiān)測(cè)中，利用視頻監(jiān)控、互聯(lián)網(wǎng)、生物傳感器和人工智能等技術(shù)，監(jiān)控并量化分析動(dòng)物行為和日?；顒?dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物傳染病的實(shí)時(shí)早期監(jiān)測(cè)，并及時(shí)發(fā)出預(yù)警，同時(shí)結(jié)合便捷準(zhǔn)確的診斷方法，提高非洲豬瘟早期發(fā)現(xiàn)的機(jī)率。