低聚原花青素對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用

呂曉楠，董 錚，李春進(jìn)，曹義坡，李 穎，馬 波，姚 旻

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎性反應(yīng)性腸病，病變部位多在乙狀結(jié)腸和直腸，好發(fā)于20～30歲青年人，常反復(fù)發(fā)作，很難治愈。遺傳、免疫調(diào)節(jié)異常和環(huán)境等因素是UC的主要病因，炎性反應(yīng)因子增多、氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是UC發(fā)病的關(guān)鍵[1, 2]。目前，UC治療主要以5-氨基水楊酸、類固醇激素、免疫抑制藥為主，但效果欠佳，還可產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)[3, 4]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)天然產(chǎn)物提取物中活性成分研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)以低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPC)為代表的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，并且口服OPC主要在結(jié)腸內(nèi)降解，胃和小腸吸收較少[5-7]。但其是否可用于UC的治療，也成為近期研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)探討OPC對(duì)葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠的治療作用及保護(hù)機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 OPC提取物(天津尖峰藥業(yè)有限公司)；DSS(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；MPO試劑盒(20160403，南京建成生物工程研究所)；美沙拉嗪(浙江華潤(rùn)三九眾益制藥有限公司)；Model 680酶標(biāo)儀(Bio-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康的8周齡雄性C57小鼠40只，體重20～25 g，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)(自由采食、飲水)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組、低劑量組和高劑量組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 正常對(duì)照組給予潔凈水自由飲用，其他4組給予2.5%的DSS溶液自由飲用，共7 d。隨后，正常對(duì)照組、模型組繼續(xù)給予潔凈水，美沙拉嗪組采用500 mg/kg美沙拉嗪灌胃，低劑量組給予500 mg/kg、高劑量組給予1000 mg/kg的OPC灌胃，連續(xù)給藥7 d后處死小鼠，留取標(biāo)本待測(cè)。

1.3.2 評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI) 每日觀察小鼠的體重、大便形狀和隱血情況，按表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI 評(píng)分[8]。將體重下降、大便形狀和隱血情況的評(píng)分相加，得出每只小鼠的評(píng)分，以評(píng)估疾病活動(dòng)情況。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)0分，體重?zé)o下降，大便形狀正常，無(wú)大便隱血/肉眼血便；(2)1分，體重下降1%～5%，大便形狀正常，無(wú)大便隱血/肉眼血便；(3)2分，體重下降6%～10%，大便形狀松散，大便隱血陽(yáng)性；(4)3分，體重下降11%～15%，大便形狀松散，大便隱血陽(yáng)性；(5)4分，體重下降>16%，大便形狀為稀便，可見(jiàn)肉眼血便。

1.3.3 結(jié)腸病理變化及評(píng)估結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index，CMDI) 取近肛門端0.5 cm處直腸至盲腸的結(jié)腸段稱重，測(cè)量長(zhǎng)度，剖開(kāi)觀察潰瘍及測(cè)量潰瘍的大小。參照文獻(xiàn)[9]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行CMDI評(píng)估。取近肛門端及有潰瘍部位結(jié)腸組織進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，觀察結(jié)腸組織病理變化。CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)0分，無(wú)潰瘍、炎性反應(yīng)及肉芽組織，病變深度為0，無(wú)纖維化；(2)1分，潰瘍<3 mm，輕度炎性反應(yīng)，有肉芽組織，病變深度限于黏膜下層，輕度纖維化；(3)2分，潰瘍>3 mm，重度炎性反應(yīng)，病變深度達(dá)肌層，重度纖維化；(4)3分，病變深度達(dá)漿膜層。

1.3.4 血清IL-10水平測(cè)定 采用ELISA法， IL-10抗小鼠單克隆抗體100 μl(1 mg/ml，pH 7.4 PBS)包被96孔板，4 ℃孵育過(guò)夜后，洗板后加入100 μl的樣品，在室溫下孵育2 h，再加入0.2 μg/ml生物素標(biāo)記的抗鼠抗體。在室溫下孵育2 h后，洗板加入抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶，孵育30 min，在37 ℃再次洗板后，加入ABTS底物。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定處使用自動(dòng)微板酶標(biāo)儀顯色測(cè)定各孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)本的OD值在曲線上計(jì)算其濃度。

1.3.5 MPO活性測(cè)定 剪取結(jié)腸近直腸端，稱取50 mg，裂解為組織勻漿，勻漿液為磷酸緩沖液(50 mM，pH6.0，內(nèi)含0.5%十六烷基溴化胺)，在冰上操作，8000 r/min離心5 min，勻漿液超聲粉碎10 s，取上清，加入到鄰聯(lián)茴香胺鹽酸鹽溶液(50 mM，pH6.0，內(nèi)含0.167 mg/ml鄰聯(lián)茴香胺和0.0005%過(guò)氧化氫)。根據(jù)試劑盒的方法測(cè)定MPO活性，在24 ℃采用自動(dòng)微板酶標(biāo)儀，在450 nm處測(cè)定吸光度(單位U/g)， 1 U對(duì)應(yīng)1 min內(nèi)所降解1 μmol過(guò)氧化氫的活性。

2 結(jié) 果

2.1 DAI評(píng)分 DSS造模后，從第3天開(kāi)始小鼠出現(xiàn)大便異常，體重下降，第5天出現(xiàn)大便潛血陽(yáng)性或者血便。同正常對(duì)照組相比，其他4組小鼠均有體重下降、大便形狀改變和便血等情況，DAI評(píng)分明顯升高，以模型組最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同模型組相比，美沙拉嗪組、低劑量組和高劑量組小鼠的體重下降、大便形狀和便血情況均有明顯改善，DAI評(píng)分降低，高劑量組與美沙拉嗪組更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表1)。

2.2 結(jié)腸病理變化及CMDI評(píng)分 結(jié)腸長(zhǎng)度方面，正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于模型組，提示結(jié)腸萎縮程度最大，受到的炎性反應(yīng)性損傷最為嚴(yán)重；美沙拉嗪組、低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸萎縮程度均有改善，結(jié)腸病理表現(xiàn)也均有明顯改善，且與劑量相關(guān)(圖1)。與正常對(duì)照組相比，其他組小鼠結(jié)腸均出現(xiàn)不同程度的潰瘍、炎性反應(yīng)、肉芽組織增生和纖維化，CMDI評(píng)分均有升高，其中模型組和低劑量組與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而美沙拉嗪組和高劑量組CMDI評(píng)分與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，美沙拉嗪組、低劑量組和高劑量組CMDI評(píng)分均降低，其中美沙拉嗪組、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 各組小鼠治療前結(jié)腸組織病理改變(HE，×100)

2.3 血清IL-10水平 與正常對(duì)照組相比，模型組、美沙拉嗪組、低劑量組小鼠血清IL-10水平均明顯降低(P<0.05)，模型組降低最為明顯；高劑量組與正常對(duì)照組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，美沙拉嗪組、低劑量組及高劑量組血清IL-10水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4 MPO活性測(cè)定 與正常對(duì)照組相比，其他4組小鼠MPO水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

(P<0.05)；與模型組相比，美沙拉嗪組和高劑量組的MPO水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組的MPO水平甚至低于美沙拉嗪組(表1)。

表1 各組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的相關(guān)指標(biāo)比較

A.正常對(duì)照組(結(jié)腸黏膜表面偶見(jiàn)分泌物)；B.治療對(duì)照組(接近正常對(duì)照組)；C.低劑量組(有淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腺有萎縮，杯狀細(xì)胞有減少)；D.高劑量組(淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腸腺萎縮減輕)；E.模型組(黏膜變薄，上皮脫落，固有層有淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腺萎縮，杯狀細(xì)胞減少)

3 討 論

UC是一種WHO確定的難治性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，因其難治愈、易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力下降和炎性反應(yīng)介質(zhì)的激活是UC重要的發(fā)病機(jī)制之一[10]。新型氨基水楊酸制藥美沙拉嗪，通過(guò)增加炎性及免疫抑制因子釋放和增加過(guò)氧化物酶合成，降低腸黏膜通透性，有緩解腸黏膜水腫的作用，但對(duì)于病情嚴(yán)重者療效較差，且存在一定的不良反應(yīng)[11]。天然抗氧化劑OPC具有保護(hù)心血管、改善疲勞、降血糖和血脂等功能，在臨床廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，OPC能夠緩解DSS誘導(dǎo)的UC癥狀，其通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1和炎性反應(yīng)通路蛋白NF-κB 的表達(dá)，進(jìn)而影響SOD、MDA來(lái)減輕結(jié)腸組織的病理?yè)p傷[12]。然而OPC是否還影響其他的氧化應(yīng)激通路，仍需進(jìn)一步探討。近年來(lái)在炎性疾病中IL-10和MPO的作用日益受到關(guān)注，因此本研究觀察OPC對(duì)DSS 誘導(dǎo)的UC大鼠IL-10和MPO的變化，探討OPC對(duì)UC可能的作用機(jī)制。

OPC是植物中廣泛存在的天然抗氧化物質(zhì)，在葡萄、大黃、銀杏等植物中含量較高。OPC分子結(jié)構(gòu)中含有富電子的羥基，是氫或中子良好的給予體，具有超強(qiáng)的抗氧化能力，能有效清除人體內(nèi)自由基。每分子OPC最多可以捕獲8個(gè)氧自由基，其抗自由基能力是維生素E的50倍，是維生素C的20倍，因此具有細(xì)胞保護(hù)、抗衰老、抗炎和抗腫瘤等作用[13]，為以氧化應(yīng)激為發(fā)病機(jī)制的疾病治療提供了良好的選擇。本研究應(yīng)用低劑量和高劑量的OPC對(duì)UC小鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，并與常規(guī)的美沙拉嗪治療對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPC干預(yù)后的小鼠無(wú)論是疾病活動(dòng)指數(shù)還是大體形態(tài)損傷指數(shù)均有明顯改善，血清IL-10明顯升高，組織MPO明顯降低，尤其是高劑量組，與美沙拉嗪治療的結(jié)果類似，均最接近于正常對(duì)照組。說(shuō)明高劑量OPC對(duì)小鼠UC治療有效，對(duì)結(jié)腸病理?yè)p傷和炎性反應(yīng)指標(biāo)的改善作用類似于常用藥物美沙拉嗪。

IL-10是一種炎性反應(yīng)和免疫抑制因子，由腸黏膜Treg細(xì)胞亞群分泌，能抑制單核巨噬細(xì)胞的化學(xué)趨化作用和特異性免疫功能，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的免疫耐受誘導(dǎo)和清道夫功能。IL-10還能聯(lián)合TGF-β產(chǎn)生廣泛的非特異性抗炎作用[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組的血清IL-10表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，說(shuō)明在UC小鼠體內(nèi)與IL-10相關(guān)的抗炎作用降低。在給予美沙拉嗪或OPC干預(yù)后，尤其在高劑量組血清IL-10水平升高水平接近于正常對(duì)照組，說(shuō)明OPC可能通過(guò)促進(jìn)腸黏膜Treg細(xì)胞亞群的IL-10分泌，緩解炎性反應(yīng)程度，發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。

MPO是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細(xì)胞中。在炎性反應(yīng)過(guò)程中，MPO以氯和過(guò)氧化氫為底物，催化產(chǎn)生次氯酸等反應(yīng)性物質(zhì)和多種自由基，在炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MPO已成為評(píng)價(jià)心血管疾病危險(xiǎn)性的重要指標(biāo)之一，但對(duì)于UC等腸道疾病的相關(guān)研究較少[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，UC模型組的MPO表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，說(shuō)明其組織內(nèi)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。在給予美沙拉嗪或OPC干預(yù)后，組織MPO降低，尤其是高劑量OPC組降低幅度最大，接近于美沙拉嗪組，說(shuō)明OPC可能通過(guò)抑制MPO的分泌，緩解炎性反應(yīng)程度和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕疾病損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中，高劑量OPC可產(chǎn)生與美沙拉嗪相似的療效，其機(jī)制可能是通過(guò)影響MPO和IL-10降低氧化應(yīng)激，緩解炎性反應(yīng)，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，減輕結(jié)腸黏膜損傷，獲得治療效果。證明OPC作為天然的抗氧化劑，具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，UC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行了初步探討，OPC對(duì)臨床UC患者的療效及應(yīng)用劑量還需進(jìn)一步深入研究。