蛋白激酶C對心臟疾病的調(diào)節(jié)機(jī)制及其抑制藥的治療作用

焦雅麗,韓 光 綜述 崔 丹 審校

心臟疾病是全人類致死與致殘的主要疾病之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時也給社會與家庭帶來較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前仍無有效的根治方法[1]。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可分為經(jīng)典型PKC、新型PKC及非經(jīng)典型PKC。PKC被激活后可參與一系列生化反應(yīng)的調(diào)控，同時可參與基因表達(dá)的調(diào)控，是控制細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)換、凋亡等過程的重要調(diào)節(jié)因子[2]。PKC在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的介質(zhì)作用，同時與多種心臟疾病的病理生理過程相關(guān)，如心肌肥大、心律失常、心力衰竭和缺血/再灌注等[3]。因此，PKC在心臟疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，而以PKC為治療靶點(diǎn)對心臟疾病的研究具有重要的臨床意義。為此，筆者就PKC在心臟疾病中的調(diào)節(jié)機(jī)制及作為治療靶點(diǎn)的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PKC對心臟疾病的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.1 經(jīng)典型PKC 經(jīng)典型PKC在其N端含有兩個C1結(jié)構(gòu)域(C1A和C1B)，其中C1B可與二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)或磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)結(jié)合而被激活，C1結(jié)構(gòu)域之后是C2結(jié)構(gòu)域，其與膜相關(guān)的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)及Ca2+結(jié)合而被激活，主要包括PKCα、PKCβ和PKC亞型[4]。

在心肌組織表達(dá)的各種PKC同工酶中，PKCα是主要成員，PKCα在心臟中的功能中具有核心作用，PKCα的主要/直接作用是調(diào)節(jié)心肌收縮力，研究顯示PKCα通過磷酸化抑制藥1(一種蛋白磷酸酶1的負(fù)調(diào)節(jié)劑)可間接影響膜磷蛋白(phospholamban，PLN)的磷酸化及其對肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶(sarco plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)的調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)節(jié)心臟收縮[5]。PKCα在心臟中的過表達(dá)會削弱收縮性，而PKCα的缺失會導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+負(fù)荷增加，從而增強(qiáng)心肌收縮性。PKCα在向心力衰竭的轉(zhuǎn)變過程及心肌細(xì)胞肥大中均起著關(guān)鍵作用，并且是肌肉收縮性的重要調(diào)節(jié)因子。盡管PLN本身在體外也被鑒定為PKCα底物，但在健康人的心肌中，佛波酯激活PKCα后分析PLN的磷酸化水平?jīng)]有增加，結(jié)果表明PKCα在體內(nèi)對PLN沒有直接作用[6]。心肌中肌肉LIM蛋白的主要作用在于直接抑制PKCα的表達(dá)，而當(dāng)心肌中缺乏功能定的肌肉LIM蛋白后，PKCα活性的長期不受抑制會導(dǎo)致心力衰竭[7]。

研究顯示，PKCβ和PKC對心臟的功能影響較小，因為缺乏PKCβ或PKC?基因?qū)π∈笮呐K表型的影響可以忽略[8]。然而，在心臟的病理過程中，PKCβ表達(dá)上調(diào)，結(jié)果表明該P(yáng)KC同工酶在心肌病中可發(fā)揮作用。鈣依賴性PKCβ主要存在于心室肌中，在人類心臟個體發(fā)育過程中，PKC-β的表達(dá)下降了90%，而在正常的成人心臟中PKCβ幾乎不表達(dá)，但衰竭心臟中PKC-βⅠ和PKC-βⅡ表達(dá)數(shù)量增加了40%以上。PKC-β高度上調(diào)，導(dǎo)致由嚴(yán)重心力衰竭引起的擴(kuò)張型心肌病重新表達(dá)。慢電壓門控鉀通道由KCNQ1和KCNE1亞基組成，是心臟主要的復(fù)極電流之一。有研究顯示，PKCβⅡ是慢電壓門控鉀通道膜定位的特異性調(diào)節(jié)因子，在包括心臟病的狀態(tài)下，PKCβⅡ的表達(dá)和激活都會顯著增加，而抑制PKCβⅡ可能對心臟病相關(guān)的獲得性QT延長具有保護(hù)作用，提示PKCβⅡ是一個潛在的抗心律失常的重要靶點(diǎn)[8]。

1.2 新型PKC 新型PKC包括PKCδ、PKCε、PKCη和PKCθ，由于缺失C2結(jié)構(gòu)域，新型PKC不能與Ca2+結(jié)合，但可被DAG激活。新型PKC對心臟的影響主要表現(xiàn)在心臟缺血再灌注損傷中的作用，且主要影響線粒體的分子功能。然而，新型PKC同工酶也被證明能夠磷酸化線粒體外的底物，包括肌球蛋白結(jié)合蛋白-C(myosin-binding protein-C，MyBPC)或電壓門控鉀離子通道Kv1.5[9]。研究顯示，PKCθ基因敲除后的小鼠可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病，并伴有心臟收縮分?jǐn)?shù)的降低，纖維化增加，心鈉素等心肌病標(biāo)志物水平升高，及p38和JNK通路的激活。而PKCδ基因敲除后，心臟代謝發(fā)生了顯著變化，糖酵解酶顯著降低，而參與β氧化和脂質(zhì)代謝的酶顯著增強(qiáng)。出生后發(fā)育過程中這兩種同工酶的喪失會導(dǎo)致心臟典型病理性肥大的變化[10]。此外，胚胎心臟發(fā)育過程中PKCδ and PKCε兩種同工酶的缺乏對大多數(shù)雙敲除胚胎具有致死性，表現(xiàn)為心臟異常肥大，心室腔嚴(yán)重受損或消失[11]。

而PKCδ和PKCε在缺血和再灌注過程中對心臟的影響卻是相反的。PKCε的活化形式定位于線粒體，可磷酸化線粒體缺血預(yù)處理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的組成部分，從而促進(jìn)心肌保護(hù)[12]；而線粒體中的PKCδ被激活后可通過降低細(xì)胞內(nèi)pH和ATP產(chǎn)生，增加線粒體ROS積累，抑制細(xì)胞保護(hù)性Akt-Bad磷酸化途徑，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，激活caspase3和誘導(dǎo)凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，激活caspase3和誘導(dǎo)凋亡，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，最終促進(jìn)缺血再灌注損傷[13]。但關(guān)于PKCδ在心臟中的作用的研究仍存在爭議，另一些研究表明，在再灌注過程中抑制PKCδ可以減輕損傷相關(guān)的病理變化，但PKCδ基因敲除不能保護(hù)心臟，反而是加重了缺血再灌注損傷，且呈現(xiàn)出更大的心肌梗死面積[14]。然而PKCδ和PKCε在限制心肌細(xì)胞生長和心室纖維化/重構(gòu)方面起著相似的作用，研究顯示PKCδ或PKCε的存在足以限制心臟對血流動力學(xué)超負(fù)荷的應(yīng)激反應(yīng)， PKCδ不破壞心肌內(nèi)皮細(xì)胞，但PKC-ε對心肌內(nèi)皮細(xì)胞可進(jìn)行一定的破壞[14]。盡管PKCη在心臟中特異表達(dá)，但其在心臟中的作用還有待進(jìn)一步研究。

1.3 非典型PKC 非典型PKC包括PKCζ和PKCλ/亞型，由于C1結(jié)構(gòu)域的缺失及C2結(jié)構(gòu)域的封閉，因此不能被DAG、PS、Ca2+激活。非典型PKC在心臟中的研究相對較少，但PKC在胚胎心臟形成中具有重要作用，研究顯示PKC主要定位于胚胎心臟心肌細(xì)胞的心腔側(cè)，可引導(dǎo)該心肌細(xì)胞的分裂，使心肌細(xì)胞分裂平面垂直于心臟的內(nèi)腔，并驅(qū)動新生心臟的心肌小梁形成。在糖尿病小鼠模型中，心肌細(xì)胞中注入PKC后可完全逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)了通過電壓依賴的L型鈣通道(CaV1.2)的鈣內(nèi)流，表明該心臟通道是該激酶的潛在底物[15]。

PKCλ在心肌中特異性表達(dá)，研究顯示PKCλ敲除的小鼠表現(xiàn)出葡萄糖攝取受損，并伴有全身性胰島素抵抗、糖耐量受損或糖尿病、胰島β細(xì)胞增生、腹部肥胖、游離脂肪酸和低密度脂蛋白-膽固醇升高、高密度脂蛋白-膽固醇降低，且PKCλ對于胰島素刺激的AMPK介導(dǎo)的心肌葡萄糖攝取及胰島素刺激的AMPK介導(dǎo)的脂肪酸攝取都是必需的。然而，PKCλ基因敲除的心肌細(xì)胞中殘留的PKC-ζ活性可最大限度地刺激葡萄糖和脂肪酸的攝取，這表明非典型PKC在心臟底物攝取的調(diào)節(jié)中是必要的，但不是限速的，并且PKC-λ和PKC-ζ在這些過程中具有互換的功能[16]。

2 PKC抑制藥對心臟疾病的治療作用

2.1 經(jīng)典型PKC抑制藥 最早研究的PKC抑制藥主要針對常規(guī)PKC，包括Ruboxistaurin(LY333531)，可特異性地靶向抑制PKCα/βⅡ，研究顯示Ruboxistaurin可通過PKcα顯著恢復(fù)豬心肌梗死模型的心肌收縮性，從而提高射血分?jǐn)?shù)與心輸出量，并最終逆轉(zhuǎn)心臟重塑[17]。

心力衰竭是糖尿病患者發(fā)病率和病死率的常見病因，通常表現(xiàn)為左心室收縮功能受損。而在大鼠模型中， Ruboxistaurin可減輕糖尿病大鼠微血管缺血/再灌注損傷的風(fēng)險，并可減輕舒張功能障礙、心肌細(xì)胞肥大、膠原沉積和保護(hù)心肌收縮力，原因可能與其通過抑制PKCβ，維持血管內(nèi)皮屏障功能與抗凋亡作用相關(guān)，表明Ruboxistaurin可預(yù)防慢性心臟微血管屏障功能障礙，改善高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接功能，抑制PKC-β可能是預(yù)防糖尿病合并心功能不全的一種新方法[18]。

心肌炎是年輕人猝死、意外死亡的主要原因。研究顯示，PKCα在自身免疫性心肌炎大鼠心臟中的表達(dá)水平和活性均上調(diào)，而在自身免疫性心肌炎最嚴(yán)重的炎性反應(yīng)期末腹腔注射PKCα抑制藥Ro-32-0432(口服雙吲哚馬來酰亞胺類抑制藥)能通過降低大鼠心臟Bax/Bcl-2比值、抑制caspase-3的表達(dá)發(fā)揮凋亡作用，還能抑制心肌纖維化和促炎因子IL-1β和IL-17的釋放，從而顯著緩解自身免疫性心肌炎。Ro-32-0432還可通過抑制PKCα而增強(qiáng)心肌的收縮力[19]。另有研究表明， Ro-32-0432或Ruboxistaurin，可以提高野生型和PKCβ/γ基因敲除小鼠的收縮力和左心室形成的壓力，但對PKCα基因敲除小鼠無明顯影響，進(jìn)一步表明上述化合物通過抑制PKCα(而不是其他PKC同工酶或相關(guān)酶)來發(fā)揮藥理作用，并且PKCα是心肌收縮力的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。

高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，心肌細(xì)胞存活率降低。心臟病發(fā)作時急性高血糖也會進(jìn)一步加重患者的預(yù)后，且急性高血糖癥不僅限于糖尿病患者，對非糖尿病患者的應(yīng)激反應(yīng)也會有不良影響，而PKCα/β抑制藥均可減弱高糖所致的上述不良反應(yīng)。研究表明，選擇性PKC抑制作用可以逆轉(zhuǎn)高血糖對心臟的破壞作用，如PKCα/β被抑制，高葡萄糖本身就可以防止缺血性損傷。而PKC抑制藥對正常血糖動物的血管無影響。因此，選擇性的PKC抑制可能是一種有用的治療工具，可限制因壓力引起的高血糖而在心臟病發(fā)作期間造成的損害[20]。

2.2 新型PKC抑制藥 雖然新型PKC家族成員在心臟中的表達(dá)沒有經(jīng)典型PKC那樣豐富，但新型PKC抑制藥也已被用于研究治療心血管疾病和心臟移植。T細(xì)胞在實體器官移植后的移植物排斥反應(yīng)中起著核心作用。因此，T細(xì)胞的免疫抑制有助于確保移植物的正常功能，并降低排斥反應(yīng)的風(fēng)險。因此，T細(xì)胞是預(yù)防同種異體移植排斥反應(yīng)或治療自身免疫性疾病的有吸引力的藥物靶點(diǎn)。PKCθ在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，是治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病(如移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病)的一個有吸引力的靶點(diǎn)。

新型2，4-二氨基嘧啶衍生物是一種PKCθ抑制藥，具有較強(qiáng)的PKCθ抑制活性，對其他PKC同工酶表現(xiàn)出良好的選擇性，研究顯示可減少營養(yǎng)不良小鼠的炎性反應(yīng)，并延長在體大鼠異位心臟移植模型中的移植物存活時間[21]。而改良的PKCθ抑制藥PI，它被用來治療鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病模型中的糖尿病性心肌病變，使用PI抑制PKCθ可顯著降低T細(xì)胞的浸潤，增加緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，減弱該動物模型的心肌纖維化，改善心肌收縮力，并導(dǎo)致稍微改善心肌收縮力[22]。另外一種PKCθ的抑制藥是索曲妥林，可通過選擇性抑制PKCθ阻止T細(xì)胞的早期激活預(yù)防大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)，且其治療機(jī)制與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制藥(他克莫司)不同。與單用高劑量他克莫司相比，索曲妥林聯(lián)合小劑量他克莫司用藥可減少心臟炎細(xì)胞浸潤、降低排斥反應(yīng)、延長心臟移植平均存活時間，同時無任何肝腎毒性作用[23]。目前，索曲妥林已在多個臨床試驗中使用，主要是作為器官移植后的免疫抑制藥或用于腫瘤的治療。有研究探討了抑制PKCε對心臟移植成功率的影響，小鼠異位移植模型中注射了PKCε抑制肽(TAT-εV1-2)。結(jié)果顯示，PKCε活性至少部分參與了同種異體心臟移植后的慢性免疫反應(yīng)，抑制PKCε活性可為延長移植物存活提供新的治療策略[24]。

2.3 非典型PKC抑制藥 特異性靶向非典型PKC家族蛋白的抑制藥較少，其中，報道最廣泛的PKCδ抑制藥rotlerin已被廣泛應(yīng)用于多種研究中，而Delcasertib(KAI-9803)是一種更具選擇性的PKCδ抑制肽。急性心肌梗死大鼠模型研究顯示，在缺血后給予KAI-9803可在1 min中內(nèi)有效進(jìn)入心肌細(xì)胞與心肌內(nèi)皮細(xì)胞，可縮小動物模型缺血/再灌注時的梗死范圍，減少心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增強(qiáng)了局部心室功能的恢復(fù)，并改善了梗塞區(qū)微血管血流，從而減輕缺血再灌注引起的心臟損傷，同時也可迅速從體循環(huán)中被清除[25]。文獻(xiàn)[26]通過納入1176例患者，使用Delcasertib 對ST段抬高心肌梗死患者進(jìn)行直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療，結(jié)果顯示，治療3個月后梗死面積主要療效終點(diǎn)無顯著差異，心電圖ST段恢復(fù)、ST段穩(wěn)定恢復(fù)時間或左心室射血分?jǐn)?shù)等次要終點(diǎn)方面，均沒有發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的顯著差異，且臨床終點(diǎn)判定(死亡、心力衰竭或嚴(yán)重室性心律失常)的比率無顯著差異。

海膽色素A是PKC的抑制藥，海膽色素A是從海膽中提取的具有抗氧化、抗菌、抗炎和螯合作用的海洋生物產(chǎn)物，是臨床藥物組織色素的活性成分，可劑量依賴性地促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，使心肌細(xì)胞具有更高的搏動頻率，促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[27]，但其具體抑制機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。PKCζ抑制藥可通過增加內(nèi)皮NO的釋放和抑制中性粒細(xì)胞釋放的超氧化物，從而減輕中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的缺血再灌注后心肌收縮功能障礙。

PKC家族的激酶在心臟中起著至關(guān)重要的作用，心肌細(xì)胞表達(dá)的PKC主要是PKCα，而其他PKC同工酶，如PKCβ、PKCδ、PKCε在健康心臟中也有較低水平的表達(dá)，或在病理性心臟重塑過程中誘導(dǎo)表達(dá)。。要全面了解它們復(fù)雜的心臟特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯后修飾的影響、PKC家族內(nèi)的串?dāng)_及其他信號通路及在重塑過程中對心臟生理和基因程序調(diào)控的影響，還需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究[28, 29]。