柚皮苷通過調(diào)控ARHI基因表達對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響

曠歷瓊，王 娜

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.消化科；2.干部保健診療中心，新疆 烏魯木齊 830001

結腸癌在世界范圍內(nèi)普遍存在，并且是癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。早期結腸癌缺乏明確且典型的癥狀，大多數(shù)患者診斷時已處于晚期[2]，因此，錯過了治療的最佳時機，預后較差。柚皮苷(4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李葡糖苷)是一種天然糖苷，屬于生物類黃酮，衍生自葡萄柚和其他柑橘類水果[3]。研究表明，柚皮苷可抑制宮頸癌細胞的生長，且隨其濃度增加抑制作用增強，促進細胞凋亡[4]。柚皮苷能顯著抑制卵巢癌細胞SKOV3的增殖并誘導其凋亡，降低侵襲能力[5]。Aplasia Ras homolog member I(ARHI)基因在人結腸癌中存在表達下調(diào)或缺失，在結腸癌中發(fā)揮抑癌基因功能[6]。ARHI在胃癌組織中的表達顯著低于正常胃黏膜上皮組織，過表達ARHI誘導胃癌細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移和侵襲，阻滯細胞周期[7]。ARHI基因在卵巢癌中低表達，過表達ARHI基因可以抑制卵巢癌SKOV3細胞生長，使SKOV3細胞阻滯于S期，誘導細胞凋亡[8]。但柚皮苷對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響，且柚皮苷是否通過調(diào)控ARHI基因表達影響結腸癌細胞的增殖和凋亡，目前尚未可知。因此，本研究考察了柚皮苷對結腸癌細胞SW620增殖和凋亡的影響及其相應的分子機制，旨在為柚皮苷治療結腸癌提供臨床前證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑結腸癌細胞株SW620購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，柚皮苷購自美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，pcDNA-ARHI、pcDNA-ARHI陰性對照pcDNA、si-ARHI、si-ARHI陰性對照si-NC購自上海GenePharma公司，Lipofectamine 2000試劑(貨號11668030)、Annexin-V-碘化丙啶(Propudium iodide，PI)凋亡試劑盒(貨號88-8005-72)購自美國Invitrogen公司，細胞周期蛋白D1(CyclinD1)(貨號ab226977)、p21(貨號ab227443)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)(貨號ab196495)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(貨號ab53154)、ARHI(貨號ab107051)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(貨號ab9485)抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(貨號ab205718)購自美國Abcam公司，PrimeScript RT Master Mix試劑盒(貨號RR036A)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(貨號RR420A)購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理將SW620細胞在含有質量濃度為100 g/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃和體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在達到90%匯合時傳代。培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，將細胞分為對照組、柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組。其中，對照組為正常培養(yǎng)的SW620細胞，柚皮苷低、中、高組分別使用5、10、20 μmol/L濃度[5]的柚皮苷作用于SW620細胞，48 h后收集細胞備用。

1.3 細胞轉染與處理根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000將所有寡核苷酸轉染到SW620細胞中。轉染后，將細胞分為pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-ARHI組(轉染pcDNA-ARHI)、對照組(正常培養(yǎng)的SW620細胞)、柚皮苷組(20 μmol/L柚皮苷處理SW620細胞)、柚皮苷+si-NC組(20 μmol/L柚皮苷和轉染si-NC的細胞)、柚皮苷+si-ARHI組(20 μmol/L柚皮苷和轉染si-ARHI的細胞)，處理48 h后，收集細胞備用。

1.4 MTT檢測細胞增殖將SW620細胞接種到96孔板中，每孔3×105個細胞，37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2條件下孵育48 h，將20 μl MTT試劑添加到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后加入150 μl二甲基亞砜，搖床震蕩培養(yǎng)10 min，置于酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞的增殖抑制率(%)。

1.5 免疫印跡實驗(Western blotting)檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI蛋白表達SW620細胞中加入放射免疫沉淀緩沖液，提取細胞的蛋白，通過BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白(30 μg)用質量濃度為100 g/L的SDS-PAGE分離，然后轉到聚偏二氟乙烯膜。室溫條件下用質量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉，2 h后將膜與抗CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)抗體4 ℃孵育，過夜。然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。使用增強的化學發(fā)光試劑和Image J軟件分析蛋白條帶。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡將SW620細胞接種到96孔板中，每孔1×106個細胞，經(jīng)不同的處理后，將細胞輕輕重懸于500 μl Annexin V結合緩沖液中，然后加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕搖動，室溫孵育10 min，通過流式細胞儀分析SW620細胞凋亡。

1.7 實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測ARHI mRNA表達分別用TRIzol溶液提取各組SW620細胞的總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒從1 μg總RNA中合成cDNA。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒，在ABI PRISM 7500實時系統(tǒng)中進行。使用的引物序列如下：ARHI：正向5′-GATTACCGCGTCGTGGTAGTC-3′，反向5′-TCAATGGTCGGCAGGTACTCA-3′；GAPDH：正向5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，反向5′-GCTCTTGCTGGGGCTGGTGG-3′。采用公式2-ΔΔCt確定ARHI mRNA水平。

2 結果

2.1 柚皮苷對結腸癌SW620細胞增殖的影響MTT和Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結腸癌SW620細胞的增殖抑制率顯著增加，CyclinD1蛋白水平顯著降低，p21蛋白表達量明顯升高，均呈濃度依賴性(P<0.05)(見表1、圖1)。

表1 柚皮苷對結腸癌SW620細胞增殖的影響

圖1 增殖相關蛋白的表達

2.2 柚皮苷對結腸癌SW620細胞凋亡的影響流式細胞術和Western blotting檢測結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結腸癌SW620細胞的凋亡率顯著增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白表達量顯著升高，均呈濃度依賴性(P<0.05)(見圖2、表2)。

圖2 柚皮苷對結腸癌SW620細胞凋亡的影響 A：凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖

表2 柚皮苷對結腸癌SW620細胞凋亡的影響

2.3 柚皮苷對結腸癌SW620細胞中ARHI基因表達的影響qRT-PCR和Western blotting檢測結果表明，與對照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結腸癌SW620細胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表達量明顯增加，并呈濃度依賴性(P<0.05)(見圖3、表3)。

表3 柚皮苷對結腸癌SW620細胞中ARHI基因表達的影響

圖3 ARHI蛋白表達

2.4 ARHI過表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響Western blotting、MTT和流式細胞術檢測結果顯示，與pcDNA組比較，pcDNA-ARHI組結腸癌SW620細胞的ARHI蛋白表達量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達量明顯增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)(見圖4、表4)。

表4 ARHI過表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

圖4 ARHI和增殖、凋亡相關蛋白表達

2.5 抑制ARHI表達逆轉了柚皮苷(20 μmol/L)對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用Western blotting、MTT和流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，柚皮苷組結腸癌SW620細胞的ARHI蛋白表達量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達量明顯增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與柚皮苷+si-NC組比較，柚皮苷+si-ARHI組結腸癌SW620細胞的ARHI蛋白表達量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達量明顯減少，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)(見表5、圖5)。

表5 抑制ARHI表達逆轉了柚皮苷對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用

圖5 ARHI和增殖、凋亡相關蛋白表達

3 討論

近年來，由于危險因素的變化以及篩查測試和治療方法的改進，結腸癌患者的發(fā)病率和死亡率有所下降，但各個國家和地區(qū)的5年生存率差異較大[9]。在中國，結腸癌的發(fā)病率逐年增加[10]。目前，化學療法是最常見的癌癥治療策略，抗癌藥的副作用仍是惡性腫瘤化學療法中的主要問題[11]。因此，仍需尋找新的結腸癌治療藥物，增加患者的治療選擇。本研究評估了不同濃度柚皮苷對結腸癌細胞SW620增殖和凋亡的影響，結果顯示，柚皮苷具有一定抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，而調(diào)控結腸癌細胞中ARHI的表達可能解釋了其抗腫瘤作用。

柚皮苷是從天然植物中提取的類黃酮物質，具有多種有益的藥理學性質，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗衰老、保護心腦血管、保護藥物性肝損傷[12-14]。根據(jù)一些體外和體內(nèi)研究的報道，生長抑制和誘導凋亡是柚皮苷在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌和胃癌等腫瘤進展中的共同作用[15]。Zhou等[16]考察了柚皮苷在甲狀腺癌中的抗腫瘤功能，結果表明，柚皮苷以劑量和時間依賴方式抑制甲狀腺癌TPC-1和SW1736細胞增殖，而以劑量依賴性誘導TPC-1和SW1736細胞凋亡。此外，柚皮苷劑量依賴性地提高細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)-3和Bax的表達，并降低了CyclinD1和Bcl-2的表達。Cai等[17]報道指出，在0.5～2 mg/kg的范圍內(nèi)，柚皮苷劑量依賴性地抑制卵巢腫瘤的體內(nèi)生長，且促進卵巢腫瘤細胞的凋亡。另外，柚皮苷顯著降低Bcl-2、CyclinD1、c-Myc和survivin的表達，其機制可能與Caspase-7、Caspase-3、Bcl-2等介導的細胞凋亡有關。柚皮苷在乳腺癌細胞MCF7和肺癌細胞A549中表現(xiàn)出明顯的細胞毒性[18]，口服柚皮苷可預防AOM/DSS誘導的C57BL/6小鼠潰瘍性結直腸炎癥和致癌作用，且無明顯的副作用，柚皮苷可以開發(fā)成為一種有希望的潰瘍性結腸炎和結直腸腫瘤的治療劑[19]。在當前研究中，柚皮苷以濃度依賴方式顯著增加SW620細胞的增殖抑制率，以及提高細胞的凋亡率和p21蛋白、Bax蛋白水平，并減少CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達量，與前述研究[16,19]一致，也為柚皮苷作為結腸癌抑制劑提供了新的證據(jù)。

本研究檢測到，不同濃度的柚皮苷明顯增加SW620細胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表達量，均呈濃度依賴性，提示柚皮苷發(fā)揮抗腫瘤活性的機制可能與調(diào)控結腸癌中的ARHI基因有關。ARHI基因屬于Ras超家族，位于人類1p31.3染色體上，包括1個啟動子、2個外顯子和1個內(nèi)含子，帶有1個687 bp的蛋白質編碼區(qū)，可編碼26 kD的蛋白質[20]。此前，ARHI基因已被證明是結腸癌[6]、甲狀腺癌[21]、膠質母細胞瘤[20]、胰腺癌和肺癌[22]等多種人類癌癥的抑癌基因，具有抑制細胞增殖和誘導凋亡作用。與配對的非癌組織相比，結腸癌組織中ARHI mRNA和蛋白表達水平顯著降低，ARHI在結腸癌中充當腫瘤抑制因子[23]。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)，ARHI過表達顯著增加結腸癌SW620細胞的抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達量，顯著降低CyclinD1和Bcl-2蛋白水平，起著抑癌基因的作用。另外，抑制ARHI表達逆轉了柚皮苷促進SW620細胞增殖抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達的作用，和逆轉了其抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表達的作用，這些結果證明，柚皮苷可能通過上調(diào)ARHI表達，抑制結腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡。

綜上所述，5、10、20 μmol/L濃度的柚皮苷可以抑制結腸癌細胞增殖，以及誘導細胞凋亡，并呈濃度依賴性，其作用機制與調(diào)控結腸癌細胞中的ARHI表達有關，這為結腸癌的臨床治療提供了有前景的藥物。