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    基于ERGO/AuNPs的電化學(xué)DNA傳感器的制備及應(yīng)用

    2016-09-15 05:32:28許世超張雪平李潤蘭張憶一周晶晶
    關(guān)鍵詞:緩沖液電化學(xué)雜交

    許世超,張雪平,李潤蘭,張憶一,周晶晶

    (1.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,天津 300387;2.天津工業(yè)大學(xué)省部共建分離膜與膜過程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387;3.天津工業(yè)大學(xué)水質(zhì)安全評價(jià)與保障技術(shù)工程中心,天津300387)

    基于ERGO/AuNPs的電化學(xué)DNA傳感器的制備及應(yīng)用

    許世超1,2,3,張雪平1,李潤蘭1,張憶一1,周晶晶1

    (1.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,天津 300387;2.天津工業(yè)大學(xué)省部共建分離膜與膜過程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387;3.天津工業(yè)大學(xué)水質(zhì)安全評價(jià)與保障技術(shù)工程中心,天津300387)

    制備了一種基于電還原石墨烯(ERGO)、金納米粒子(AuNPs)修飾玻碳電極的電化學(xué)DNA傳感器,應(yīng)用于大腸桿菌O157:H7的快速、靈敏檢測.首先將滴加在玻碳電極表面的氧化石墨烯進(jìn)行電還原,然后通過電沉積方法將金納米粒子均勻平鋪在電極表面.利用金納米粒子和氨基之間的共價(jià)鍵作用將端氨基修飾的探針DNA固定在電極表面,完成電化學(xué)DNA傳感器的制備,并對目標(biāo)DNA進(jìn)行了定性與定量檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:所制備的傳感器具有良好的選擇性、準(zhǔn)確性,并且操作簡單易行,對目標(biāo)DNA的檢測限為7.735×10-13mol/L,檢測范圍為1×10-12~1×10-8mol/L.

    電化學(xué)DNA傳感器;電還原石墨烯;金納米粒子;大腸桿菌檢測

    電化學(xué)DNA傳感器是把分析化學(xué)領(lǐng)域的電化學(xué)分析檢測方法與DNA生物技術(shù)相結(jié)合,通過檢測目標(biāo)DNA雜交前后的電信號變化實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)檢測物的定性定量檢測[1],具有制備簡單快速、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢,已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、藥物分析、食品安全檢驗(yàn)、臨床疾病診斷和新藥開發(fā)等領(lǐng)域[2-4].納米材料的開發(fā)與應(yīng)用為電化學(xué)DNA傳感器的制備提供了新的途徑[5-6].石墨烯由于良好的機(jī)械性質(zhì)、大的比表面積、極強(qiáng)的導(dǎo)電導(dǎo)熱性能而引起了廣泛關(guān)注[7-9].Sun等[4]應(yīng)用石墨烯等設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)DNA傳感器,實(shí)現(xiàn)了對單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌的檢測;Zhang等[10]制備了一種用于檢測HIV病毒的電化學(xué)DNA傳感器,并將其制作成微電極陣列,實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)傳感器的器件化和實(shí)際應(yīng)用.本文采用電還原石墨烯和金納米粒子對玻碳電極(GCE)修飾,增強(qiáng)電子在電極表面的傳輸[11],設(shè)計(jì)了一種用于檢測大腸桿菌O157:H7的電化學(xué)DNA傳感器.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

    所用藥品包括:亞甲基藍(lán)(MB)、氯金酸、石墨粉,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA),上海市晶純化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;鐵氰化鉀、濃硫酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、30%過氧化氫,均為天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;DNA特征片段,天津市博益特生物科技有限公司產(chǎn)品;Tris-HCl緩沖液(pH= 7.2,50 mmol/L,含20 mmol/L NaCl)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.0,0.1 mol/L)、檸檬酸鈉緩沖液(2×SSC)(pH=7.0)、TE緩沖液(pH=8.0),均為自配.

    所用儀器包括:LK2006A型電化學(xué)工作站,天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司提供;Nicolet 6700型紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;JEM-2100型透射電子顯微鏡,日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品;S4800型掃描電子顯微鏡,日本日立公司產(chǎn)品.

    所用DNA序列包括:

    端氨基標(biāo)記的探針DNA:5’-NH2-GGTAGCGTCGCATTACGAGATGTGGTGCGG-3’

    完全互補(bǔ)目標(biāo)DNA:5’-CCGCACCACATCTCGTAATGCGACGCTACC-3’

    單堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA:5’-CCGCACTACATCTCGTAATGCGACGCTACC-3’

    兩堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA:5’-CCGAACCACATCTCGTAATACGACGCTACC-3’

    多堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA:5’-CCGTGACACACATCGTGATGCGGTGCTAGC-3’

    1.2實(shí)驗(yàn)步驟

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程如圖1所示.

    1.2.1電化學(xué)DNA傳感器的制備

    首先,將制備好的氧化石墨烯配制成2.0 g/mL的溶液,滴加在預(yù)處理干凈的電極表面,靜置10 min后用清水沖洗.在0.1 mol/L PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,掃描范圍-1.7~0 V,掃速50 mV/s,至峰形及峰電流值穩(wěn)定不變?yōu)橹?,完成氧化石墨烯的電還原.之后,將電極取出并用2次水沖洗干凈,放在5.0 mmol/L的氯金酸溶液中進(jìn)行電沉積,電勢-0.4 V,沉積時(shí)間300 s,在電極表面形成一層致密的金納米粒子膜.最后,將5 μL端氨基修飾的探針DNA(10 μmol/L)和10 μL Tris-HCl緩沖液滴加在修飾完成的電極表面,40℃條件下保持1 h,完成傳感器的制備.將制備完成的傳感器置于2×10-5mol/L的亞甲基藍(lán)溶液中自組裝5 min,使亞甲基藍(lán)分子充分連接在DNA鏈上,指示DNA鏈段的連接數(shù)量.將制備好的傳感器以不同掃速(0.05、0.1、0.2、…、0.9、1.0 V/s)在 0.1 mol/L PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,以研究電子在電極表面的擴(kuò)散機(jī)理.

    1.2.2目標(biāo)DNA檢測

    將單鏈DNA修飾的玻碳電極置于一定濃度的目標(biāo)DNA的2×SSC溶液中,在37℃條件下進(jìn)行DNA雜交實(shí)驗(yàn),雜交時(shí)間1 h.雜交完成后,使雜交溶液自然冷卻至室溫,然后將電極取出,并用Tris-HCl緩沖液和超純水依次沖洗電極表面,將未雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA除去,最后浸入亞甲基藍(lán)溶液中二次浸泡5 min,指示目標(biāo)DNA的雜交數(shù)量.本文對該傳感器的選擇性和檢測限進(jìn)行研究.傳感器選擇性實(shí)驗(yàn)中,目標(biāo)DNA選用不同堿基錯(cuò)配的DNA,濃度為0.5 μmol/L;檢測限測定實(shí)驗(yàn)中,完全互補(bǔ)DNA的濃度分別為1.0×10-12、1.0×10-11、1.0×10-10、1.0×10-9、1.0×10-8mol/L.檢測時(shí),采用差分脈沖伏安法,掃描底液為Tris-HCl緩沖液,掃描范圍-0.8~0.2 V,脈沖幅度50 mV,脈沖寬度50 ms,掃描速率25 mV/s.

    2  結(jié)果與討論

    2.1石墨烯的結(jié)構(gòu)表征

    氧化石墨烯的表面形貌如圖2所示.

    由圖2可以看出,氧化石墨烯呈片層結(jié)構(gòu),表面粗糙,有明顯褶皺和卷曲,這是為了降低它的表面能,使其片層穩(wěn)定存在.從氧化石墨烯的透射電鏡圖可以很明顯地看到氧化石墨烯經(jīng)超聲剝離后的薄片層結(jié)構(gòu),顏色較深的部分為片層的重疊,可以看到明顯的褶皺,與掃描電鏡圖相對應(yīng).

    圖2 氧化石墨烯的掃描電鏡圖和透射電鏡圖Fig.2 SEM and TEM images of GO

    氧化石墨烯的傅里葉紅外譜圖如圖3所示.

    圖3 氧化石墨烯的傅里葉紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of GO

    由圖3可以看出,3 430 cm-1附近較寬、較強(qiáng)的吸收峰為—OH的伸縮振動(dòng)峰;1 750 cm-1附近的吸收峰為羧基上的—C=O伸縮振動(dòng)峰;而1 631 cm-1附近的吸收峰則歸屬于氧化石墨烯碳六元環(huán)結(jié)構(gòu)單元上的—C=C—伸縮振動(dòng)峰;1 265 cm-1左右的吸收峰為C—O伸縮振動(dòng)峰,1 044 cm-1左右吸收峰則屬于C—O—C;此外,1 397 cm-1附近的吸收峰為O—H變形振動(dòng)峰.說明氧化石墨烯表面含有豐富的羥基、羧基、環(huán)氧基等官能團(tuán),為其結(jié)合其他分子提供了有利條件.

    2.2電化學(xué)DNA傳感器結(jié)構(gòu)表征

    傳感器制備過程中電極表面形貌如圖4所示.

    圖4 電極表面形貌圖Fig.4 SEM images of GCE surface

    由圖4(b)可以看出,石墨烯在電極表面鋪設(shè)均勻,無明顯聚集;由圖4(c)可以看到,經(jīng)過電沉積后電極表面形成了一層致密的納米金膜,將石墨烯層完全覆蓋,金納米粒子粒徑較大、顆粒較均一,有輕微團(tuán)聚,這是由于電沉積時(shí)氯金酸濃度太大,同時(shí)電沉積時(shí)間、沉積電位也對金納米粒子粒徑有顯著影響. 圖5所示為兩步修飾電極步驟的電化學(xué)表征.

    圖5 電還原石墨烯和金納米粒子修飾電極過程的循環(huán)伏安表征圖Fig.5 CV characterization of electrode modification process with ERGO and AuNPs

    由圖5可以看到,電化學(xué)還原石墨烯和金納米粒子的修飾使得電信號有較明顯的增大作用,這是由于二者的存在增大了電活化面積,加快了電子在電極表面的傳輸速率.為研究電子在電極表面的擴(kuò)散機(jī)理,將制備好的傳感器不同掃速在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,如圖6所示.

    圖6 傳感器在PBS緩沖液中不同掃速下的循環(huán)伏安圖以及氧化還原峰電流擬合直線圖Fig.6 CV of sensor at different scan rates in PBS buffer,and linear fitting curves about redox peak currents

    由圖6可以看出,隨著掃速增大,電信號值增大,峰電位差也略有增加.將氧化峰和還原峰電流值對掃速進(jìn)行線性擬合,得到兩條直線,相性相關(guān)度均達(dá)到0.99以上,說明電子在電極表面的傳遞屬于表面控制過程.應(yīng)用拉維龍方程[12-13]進(jìn)行計(jì)算

    式中:ip為還原峰電流值;v為掃速;A為電極表面面積;n為電子轉(zhuǎn)移數(shù);F為法拉第常數(shù);R為摩爾氣體常數(shù);T為熱力學(xué)溫度;Ks為直接電子傳遞速率常數(shù);m為一個(gè)與峰電位差和電子轉(zhuǎn)移數(shù)n的乘積(nΔEp)相關(guān)的量.可以算得本實(shí)驗(yàn)中電化學(xué)DNA傳感器電極表面含有5.37×10-12mol/cm的ssDNA探針.

    2.3對目標(biāo)DNA的檢測效果

    DNA雜交過程的循環(huán)伏安表征如圖7所示.

    圖7DNA雜交過程的循環(huán)伏安表征圖Fig.7 Cyclic voltammograms of DNA hybridization process

    由圖7中b、c曲線可以看到,目標(biāo)DNA雜交完成后,電信號值有一個(gè)明顯的降低,這是因?yàn)槟繕?biāo)DNA的磷酸骨架顯電負(fù)性,對電子傳遞有阻礙作用.然而,由圖7中b、d曲線看出,二次浸泡亞甲基藍(lán)后,電信號值幾乎成倍增加,這是因?yàn)殡p鏈DNA為亞甲基藍(lán)提供了更多的結(jié)合位點(diǎn).由此也能說明,目標(biāo)DNA成功地與探針DNA實(shí)現(xiàn)了雜交.

    將傳感器與同一濃度的各種DNA分別進(jìn)行雜交并浸泡亞甲基藍(lán),以考察該傳感器的選擇性,結(jié)果如圖8所示.

    圖8 傳感器與各種DNA雜交后的差分脈沖伏安圖Fig.8 Differential pulse voltammograms(DPVs)after hybridization of biosensor with different DNAs

    由圖8可以看出,當(dāng)與完全互補(bǔ)的DNA進(jìn)行雜交后,其電信號值最大,且與其他幾種情形下的信號值差別較大,說明可以很好地區(qū)分不同的DNA,即該傳感器的選擇性還是不錯(cuò)的.

    將傳感器對不同濃度的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交,采用差分脈沖伏安法對電流值進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖9所示.

    圖9 傳感器與不同濃度目標(biāo)DNA雜交的差分脈沖曲線及濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 DPVs and standard concentration curves of electrochemical DNA biosensor hybridized with target DNA in different concentrations

    由圖9可以看出,電流值大小與目標(biāo)DNA濃度呈正相關(guān)關(guān)系.將電流值與目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行線性擬合,可以得到一條直線,線性相關(guān)度在0.99以上.采用3σ法對檢測限進(jìn)行計(jì)算,可得實(shí)驗(yàn)中傳感器的檢測限為7.735×10-13mol/L,檢測范圍為1×10-12~1× 10-8mol/L,檢測效果優(yōu)于其他類似大腸桿菌0157:H7傳感器[14-15].

    3結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)成功制備了基于電還原石墨烯和金納米粒子的電化學(xué)DNA傳感器用于檢測大腸桿菌O157:H7.證明了傳感器表面電子的傳遞屬于表面控制過程,計(jì)算得電極表面探針DNA的濃度大約是5.37× 10-12mol/cm.最終得到傳感器的檢測限是7.735×10-13mol/L,檢測范圍是1×10-12~1×10-8mol/L.所得傳感器的選擇性好,靈敏度也較高,對大腸桿菌O157:H7的實(shí)際檢測應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義.然而,就電化學(xué)DNA傳感器而言,由于國內(nèi)起步較晚,發(fā)展尚不完善,在提升電極材料性能、發(fā)展更高效的DNA固定方法、DNA微電極陣列等方面需要引起大家更廣泛的關(guān)注.

    [1]THEVENOT D,TOTH K,DURST R.Electrochemical biosensors:Recommended definitions and classification[J].Biosensors and Bioelectronics,2001,16(1):121-131.

    [2]ZHANG S,WRIGHT G,YANG Y.Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction[J]. Biosens Bioelectron,2000,15:273-282.

    [3]IVNITSKI D,ABDEL-HAMI I,ATANASOV P.Application of electrochemical biosensors for detection of food pathogenic bacteria[J].Electroanalysis,2000,12:317-325.

    [4]SUN W,QI X,ZHANG Y.Electrochemical DNA biosensor for the detection of Listeria monocytogenes with dendritic nanogold and electrochemical reduced graphene modified carbon ionic liquid electrode[J].Electrochim Acta,2012,85:145-151.

    [5]楊海朋,陳仕國,李春輝,等.納米電化學(xué)生物傳感器[J].化學(xué)進(jìn)展,2009,21(1):210-216. YANG H P,CHEN S G,LI C H,et al.Nano electrochemical biosensor[J].Advances in Chemical,2009,21(1):210-216 (in Chinese).

    [6]項(xiàng)純.談納米材料修飾電極在生物電化學(xué)中的應(yīng)用 [J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品,2009(9):17-20. XIANG C.Application of nanomaterials in biological electrochemistry[J].China New Technology and New Products,2009 (9):17-20(in Chinese).

    [7]LI P,LIU J,WANG H.Electrochemical performance and detection of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine at single-stranded DNA functionalized graphene modified glassy carbonel ectrode [J].Biosensors and Bioelectronics,2014,67:139-145

    [8]VASILIOS G,MICHAL O.Functionalization of graphene:Covalent and non-covalent,approaches,derivatives and applications[J].Chemical Review,2012,112:6156-6214

    [9]CHEN D,F(xiàn)ENG H,LI J.Graphene oxide:Preparation,functionalization,and electrochemical applications[J].Chemical Review,2012,112:6027-6053.

    [10]ZHANG D,PENG Y,QI H.Label-free electrochemical DNA biosensor array for simultaneous detection of the HIV-1 and HIV-2 oligonucleotides incorporating different hairpin-DNA probes and redox indicator[J].Biosensors and Bioelectronics,2010,25(5):1088-1094.

    [11]RAO C N R,BISWAS K,SUBRAHMANYAM K S.Graphene the new nanocarbon[J].Journal of Materials Chemistry,2009,19:2457-2469.

    [12]LAVIRON E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems[J].Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry,1979,101(1):19-28.

    [13]LAVIRON E.The use of linear potential sweep voltammetry and of ac voltammetry for the study of the surface electrochemical reaction of strongly adsorbed systems and of redox modified electrodes[J].Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry,1979,100(1):263-270.

    [14]ZHANG Y,ZHANG K,MA H.Electrochemical DNA biosensor based on silver nanoparticles/poly(3-(3-pyridyl)acrylic acid)/carbon nanotubes modified electrode[J].Analytical Biochemistry,2009,387(1):13-19.

    [15]MIAO X,GUO X,XIAO Z.Electrochemical molecular beacon biosensor for sequence-specific recognition of double-stranded DNA[J].Biosensors and Bioelectronics,2014,59:54-57.

    Preparation and applications of electrochemical DNA biosensor based on ERGO/AuNPs

    XU Shi-chao1,2,3,ZHANG Xue-ping1,LI Run-lan1,ZHANG Yi-yi1,ZHOU Jing-jing1
    (1.School of Environmental and Chemical Engineering,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China;2.State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Processes,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China;3.Tianjin Engineering Center for Safety Evaluation of Water Quality&Safeguards Technology,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China)

    A new electrochemical DNA biosensor was prepared based on glassy carbon electrode(GCE)modified by electrically reduced graphene(ERGO)and gold nanoparticles(AuNPs),which was applied to detect the target DNA of Escherichia Coli O157:H7 rapidly and sensitively.After the electrochemical reduction of the graphene oxide on the surface of GCE,a stable Au-nanoparticles film will be formed on the surface of electrode through electrodeposition.Moreover,probe DNA was attached on electrode surface through the covalent band between AuNPs and amino-groups of DNA end.At this point,the electrochemical DNA biosensor was obtained.At last,the qualitative and quantitative analyses of target DNA were represented.Results showed this fabricated electrochemical DNA biosensor was of good selectivity,sensitivity and easy operation,the limit and range of detection for target DNA were 7.735×10-13mol/L and 1×10-12—1×10-8mol/L,respectively.

    electrochemical DNA biosensor;electrically reduced graphene;Au-nanoparticles(AuNPs);detection of Escherichia Coli

    TP212.3

    A

    1671-024(2016)04-0059-05

    10.3969/j.issn.1671-024x.2016.04.010

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