銀杏花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的優(yōu)化

曾祥久

(丹東坤霖林業(yè)服務(wù)有限公司，遼寧 丹東 118200)

銀杏Ginkgobiloba是銀杏科唯一的植物，我國(guó)獨(dú)一無(wú)二的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種。因其用途多樣，在造林、制藥和保健中具有舉足輕重的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[1-2]。在銀杏常規(guī)雜交育種實(shí)踐中，花粉作為遺傳信息的載體傳遞給母本來(lái)選育優(yōu)質(zhì)雜交后代[3]。父本自身花粉活力的大小對(duì)育種工作有著直接的影響[4]。因此，研究其花粉萌發(fā)特性對(duì)育種工作具有積極意義。雖然前人對(duì)銀杏花粉的離體萌發(fā)開(kāi)展了一些研究，但是其所使用的培養(yǎng)基配方比較復(fù)雜，花粉萌發(fā)的培養(yǎng)時(shí)間也比較長(zhǎng)。因此，尋找一種適宜而簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基用于銀杏花粉離體萌發(fā)是非常必要的。本研究旨在通過(guò)蔗糖、硼和鈣離子這3種重要的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響，優(yōu)化花粉萌發(fā)培養(yǎng)基成分，為后續(xù)雜交育種中花粉生活力測(cè)定提供一套簡(jiǎn)單易行的方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

試材為銀杏花粉。2017年4月21日在丹東市采集帶有花序的枝條，放在有冰袋的保溫盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。取下花藥于陰涼干燥處放置1 d后采集花粉。用500目細(xì)篩篩選花粉，放置于1.5 mL離心管內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

基本培養(yǎng)基含0.7%瓊脂、0.1%硝酸鉀、0.2%硫酸鎂。添加蔗糖、硼酸和氯化鈣后，培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，在直徑60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)倒一薄層培養(yǎng)基。將花粉均勻撒播在冷卻的培養(yǎng)基上，放在25 ℃恒溫恒濕箱5 d。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)花粉數(shù)大于30的視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，重復(fù)3次。

1.2.1 單因子試驗(yàn)

在基本培養(yǎng)基中加入蔗糖，質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150、200 g·L-1；在基本培養(yǎng)基中加入硼酸，質(zhì)量濃度分別為0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1；在基本培養(yǎng)基中加入氯化鈣，質(zhì)量濃度分別為0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1。測(cè)定不同處理的花粉萌發(fā)率。

1.2.2 正交試驗(yàn)

在單因子試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)蔗糖、硼酸、氯化鈣3因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，如表1。測(cè)定不同處理的花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響

2.1.1 蔗糖對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響

從表2可以看出，花粉在蔗糖質(zhì)量濃度50 g·L-1的培養(yǎng)基，萌發(fā)率較對(duì)照顯著提高；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 g·L-1時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最高14.67%，為對(duì)照的2.6倍；而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到150、200 g·L-1時(shí)，萌發(fā)率較50 g·L-1和100 g·L-1時(shí)明顯下降。方差分析表明，蔗糖質(zhì)量濃度為50 g·L-1和100 g·L-1時(shí)萌發(fā)率無(wú)顯著差異(P>0.05)?？梢?jiàn)，適宜蔗糖質(zhì)量濃度明顯促進(jìn)了銀杏花粉萌發(fā)，高于適宜濃度其作用明顯降低。

2.1.2 硼酸對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響

從表3可以看出，當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度為10 mg·L-1和20 mg·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率較對(duì)照顯著提高，但兩者間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最高值10.31%，為對(duì)照的1.8倍；當(dāng)質(zhì)量濃度為60、80、100 mg·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率逐漸降低，可見(jiàn)花粉萌發(fā)受到了抑制。

表1 L25(53)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 蔗糖對(duì)銀杏花粉離體萌發(fā)的影響

表3 硼酸對(duì)銀杏花粉離體萌發(fā)的影響

2.1.3 氯化鈣對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響

從表4可以看出，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度為10～40 mg·L-1，隨著濃度升高萌發(fā)率也升高；氯化鈣質(zhì)量濃度為40 mg·L-1時(shí)，萌發(fā)率最高18.43%，為對(duì)照的3.2倍；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，萌發(fā)率顯著降低，說(shuō)明花粉萌發(fā)受到了抑制。方差分析表明，硼酸40 mg·L-1的萌發(fā)率與其他質(zhì)量濃度下的花粉萌發(fā)率存在顯著差異(P<0.05)。

表4 氯化鈣對(duì)銀杏花粉離體萌發(fā)的影響

2.2 正交試驗(yàn)對(duì)銀杏花粉萌發(fā)的影響

銀杏花粉離體萌發(fā)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

方差分析表明，蔗糖、硼酸、氯化鈣均能顯著促進(jìn)銀杏花粉萌發(fā)(P<0.05)。100 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1硼酸、40 mg·L-1氯化鈣的花粉萌發(fā)率最高，即表1中12號(hào)處理，且與其他處理差異顯著(P<0.05)。因此，銀杏花粉最佳培養(yǎng)基組分為：100 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1硼酸、40 mg·L-1氯化鈣。

表5 銀杏花粉離體萌發(fā)正交試驗(yàn)

3 討 論

離體培養(yǎng)法是目前一種常用的花粉生活力測(cè)定方法,其培養(yǎng)基主要成分包括蔗糖、硼和鈣離子。蔗糖為花粉萌發(fā)提供必需的碳源和氮源，它不僅在花粉管壁合成中發(fā)揮著重要作用[5]，還為花粉的代謝提供物質(zhì)補(bǔ)充，并平衡著花粉萌發(fā)過(guò)程中的滲透壓。硼在參與花粉管膜的合成和氧的吸收[6]，授粉過(guò)程中，花粉中硼含量低，需要從柱頭中吸收，必要時(shí)需噴施含硼的營(yíng)養(yǎng)液。因此，在育種實(shí)踐中，花期應(yīng)噴施含硼的營(yíng)養(yǎng)液輔助受精過(guò)程，注意濃度不宜過(guò)高。鈣離子則是植物代謝重要的調(diào)控因子[7]，是花粉發(fā)育必不可少的金屬元素。從本研究可以看出，在適宜的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蔗糖、硼和鈣離子3種營(yíng)養(yǎng)成分均促進(jìn)銀杏花粉的萌發(fā)，過(guò)高質(zhì)量濃度反而在不同程度上抑制花粉萌發(fā)，這與胡君艷[8]的研究一致，說(shuō)明過(guò)高質(zhì)量濃度打破了花粉的內(nèi)外滲透壓，從而影響了養(yǎng)分的吸收。