不同時間點針刺對穴區(qū)HSP27、MAP4的影響＊

韋 婷，白艾靈，王 宇，劉 祎，趙征宇，蔡定均

（成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 成都 610037）

針灸治療疼痛療效肯定，其鎮(zhèn)痛效果已經(jīng)得到了世界公認[1-2]。據(jù)美國自然神經(jīng)科學(xué)雜志[3]報道，針灸可以促使穴位局部釋放一些天然的止痛物質(zhì)，最終達到鎮(zhèn)痛的目的。針刺鎮(zhèn)痛具有明顯的時間差異特性，中醫(yī)的傳統(tǒng)時間針灸方法，如子午流注針法、靈龜八法用于痛證治療已取得良好療效[4-5]?，F(xiàn)代研究認為，針灸鎮(zhèn)痛的時間效應(yīng)與5-羥色胺和去甲腎上腺素[6]、香草酸瞬時電位受體4[7]、P2X3 受體[8]及穴區(qū)嘌呤信號[9]等有關(guān)。但目前尚缺乏細胞骨架相關(guān)分子對不同時間點針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)影響的研究。針刺可以使穴區(qū)局部微環(huán)境發(fā)生改變，引起局部神經(jīng)感受器的興奮、細胞功能的激活、各種相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的釋放以及其相互作用形成針刺局部反應(yīng)小網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮針刺鎮(zhèn)痛等效應(yīng)，進而調(diào)節(jié)機體失衡狀態(tài)[10-12]。成纖維細胞作為皮下結(jié)締組織中主要的感受性和效應(yīng)性細胞，在針刺力學(xué)轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，成纖維細胞具有獨立振蕩作用的外周生物鐘，該自主生物鐘對肌動蛋白細胞骨架施加節(jié)律性調(diào)節(jié)，驅(qū)動自身節(jié)律的運行[13-14]。本課題組前期在針刺鎮(zhèn)痛時間效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，不同時間點針刺對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎痛閾的影響不同，在ZT12 和ZT16 時間點針刺均具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且該效應(yīng)具有時間差異[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種鎮(zhèn)痛時間效應(yīng)差異的產(chǎn)生與針刺調(diào)整穴區(qū)局部成纖維細胞骨架蛋白有關(guān)，不同時間點針刺對成纖維細胞骨架重構(gòu)的作用以及對其蛋白表達量的影響不同，其中在ZT12和ZT16時間點，成纖維細胞骨架形態(tài)改變具有顯著差異[15]。那么針刺鎮(zhèn)痛的不同時間效應(yīng)是如何影響成纖維細胞骨架重構(gòu)的，仍有待進一步研究。

引起成纖維細胞骨架重構(gòu)中間環(huán)節(jié)的力-化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受多種蛋白的調(diào)控。其中熱休克蛋白27（heat shock protein，HSP27），不僅參與細胞的增殖、分化和細胞凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，同時具有保護細胞免受各種應(yīng)激因素損傷，促進蛋白質(zhì)正確折疊的功能[16-17]。此外，微管相關(guān)蛋白4（microtubule associated protein 4，MAP4）是一種廣泛表達于全身組織的微管動力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白，其能促進微管聚合，維持細胞骨架和連接結(jié)構(gòu)的完整，在維持微管穩(wěn)定方面起著重要的作用[18]。基于此，本研究選擇時間針灸效應(yīng)明確的痛證為載體，擬觀察在ZT12、ZT16 兩個時間點針刺對成纖維細胞骨架調(diào)控相關(guān)蛋白分子的變化，從而探討不同時間針刺對成纖維細胞骨架調(diào)控的相關(guān)原理，以期揭示針刺時間效應(yīng)的始動機制，為擇時針刺鎮(zhèn)痛提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

清潔級雄性SD 大鼠，7-8 周齡，體質(zhì)量200 ± 20 g，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（川）2013-15。于成都中醫(yī)藥大學(xué)時間生物醫(yī)學(xué)節(jié)律室的隔離單元內(nèi)進行大鼠馴化。自動光暗控制，7:00-19:00 為光照期，室溫22℃±1℃，相對濕度50%-60%，每隔1 小時自動通風(fēng)1 次。經(jīng)1 周馴化后，選取光暗周期同步的大鼠，采用疼痛甩尾測試儀進行痛閾基礎(chǔ)值的測定和篩選，納入篩選標(biāo)準(zhǔn)：在3-10 s之間的輻射熱可引起甩尾反應(yīng)者。然后將篩選留用的36 只大鼠，根據(jù)痛閾值完全隨機分為造模組24 只，空白組12 只。造模成功的大鼠以痛閾值隨機分為針刺組和模型組，每組12只。根據(jù)針刺時間點的不同又分為ZT12（19:00）、ZT16（23:00）（ZT0 開燈時間7:00，ZT12關(guān)燈時間19:00）2個時間亞組。每個對應(yīng)時間點各18只，隨機為空白組、模型組和針刺組，每組6只。

1.2 主要試劑與設(shè)備

完全弗氏佐劑（CFA，批號：101M8711，美國Sigma公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：KGP903，南京凱基生物公司）；預(yù)染蛋白Marker（批號：00215343，美國NEB公司）；ECL發(fā)光試劑盒（批號：BL520A，美國Thermo 公司）；Anti-HSP27 抗體（批號：ab109376）、Anti-MAP4 抗體（批號：ab232947）、Anti-β-actin 抗體（批號：ab8227）和山羊抗兔IgG（H+L）（批號：ab6721）均由英國abcam 公司生產(chǎn)。疼痛甩尾測試儀（型號：7360 型，UGOBASILES． R． L，意 大 利Biological Research Apparatus）；DYY-6C 電 泳 儀、ChemiDoc XRS+Systems 凝膠掃描成像儀以及化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀均由美國BIO-RAD 公司提供；TGL-16G-A 型高速低溫離心機由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 模型復(fù)制

在ZT12 和ZT16 兩個時間點進行模型復(fù)制，造模組24 只大鼠在右側(cè)足墊部皮內(nèi)注射CFA 0.1 ml，每個時間點各12只；空白組12只大鼠注射生理鹽水0.1 ml，每個時間點各6 只。24 h 后，造模組大鼠右后足爪明顯腫脹，活動受限跛行，輻射熱甩尾測定大鼠痛閾潛伏期縮短，表明造模成功。

1.4 治療方法

采用自制大鼠固定器固定大鼠，在ZT12、ZT16 對針刺組大鼠進行針刺治療，選擇大鼠右側(cè)“足三里”穴（ST36），消毒后直刺7 mm，留針30 min，每5 min 采用捻轉(zhuǎn)平補平瀉法行針1次，每次1 min，頻率120次/min，1 次/d，治療7 d。對兩個時間點的其余組大鼠用相同方法抓取及固定30 min。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

免 疫 印 跡 法（Western blot）測 定 穴 區(qū)HSP27、MAP4 蛋白表達：針刺治療結(jié)束后，股動脈放血法處死大鼠，提取大鼠患側(cè)足三里局部的皮膚和皮下組織，裂解液裂解10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA法測定樣品蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量后，煮沸10 min變性蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，TBS 浸濕膜后，封閉1 h，膜上滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，孵育2 h，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。結(jié)果以目的蛋白相對表達量表示（目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值（IOD）/內(nèi)參積分光密度值（IOD）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）來描述，經(jīng)過正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，各組間比較用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 法，方差不齊者采用Tamhane's T2 法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 ZT12、ZT16兩個時間點各組大鼠穴區(qū)皮膚HSP27蛋白表達量

表1 主體間效應(yīng)的檢驗（因變量:針刺組HSP27）

2.1 不同時間點針刺對大鼠穴區(qū)HSP27 蛋白表達量的影響

針刺大鼠足三里7 天后，由圖1 結(jié)果所示，相同時間點不同組間比較：在ZT12 時間點，模型組HSP27 蛋白表達量較空白組明顯增高（P＜0.05）；針刺組HSP27表達量較模型組明顯降低（P＜0.05）。在ZT16 時間點，模型組HSP27 表達量較空白組明顯增高（P＜0.05）。不同時間點相同組間比較：在空白組與針刺組中，ZT16 時間點HSP27 表達量較ZT12 時間點顯著增高（P＜0.01）。為排除不同時間點造模對針刺組HSP27 蛋白表達的混雜影響，故將兩個時間點模型組的HSP27 蛋白表達量納入?yún)f(xié)變量，運用協(xié)方差分析不同時間針刺對HSP27 蛋白的調(diào)整力度。如表1 和圖2所示，不同時間點造模對針刺組HSP27 蛋白表達具有顯著的影響（P＜0.01），在排除不同時間點造模對針刺調(diào)節(jié)作用的干擾后，在兩個不同時間點針刺對HSP27 蛋白表達量的影響仍然存在顯著的差異（P＜0.01），且ZT16 時間針刺對該蛋白的調(diào)整幅度大于ZT12時間點。

圖2 不同時間點針刺對HSP27的調(diào)整幅度

圖3 ZT12、ZT16兩個時間點各組大鼠穴區(qū)皮膚MAP4蛋白表達量

2.2 不同時間點針刺對大鼠穴區(qū)MAP4 蛋白表達量的影響

針刺治療7 天后，由圖3 結(jié)果所示，相同時間點不同組間比較：在ZT12 時間點，模型組大鼠穴區(qū)MAP4表達量較空白組明顯增高（P＜0.05）；不同時間點相同組間比較：空白組ZT16 時間點大鼠穴區(qū)MAP4 表達量較ZT12 時間點明顯增高（P＜0.05）；針刺組大鼠穴區(qū)MAP4 表達量ZT16 時間點較ZT12 時間點明顯增高（P＜0.05）。為排除不同時間點造模對針刺組MAP4蛋白表達的混雜影響，將兩個時間點模型組的MAP4蛋白表達量納入?yún)f(xié)變量，運用協(xié)方差分析不同時間針刺對MAP4蛋白的調(diào)整力度。如表2和圖4所示，不同時間點造模對針刺組MAP4蛋白表達具有顯著的影響（P＜0.01），在排除不同時間點造模對針刺調(diào)節(jié)作用的干擾后，在兩個不同時間點針刺對MAP4 蛋白表達量的影響仍然存在明顯的差異（P＜0.05），且ZT16 時間點針刺對MAP4 蛋白表達量的調(diào)整幅度大于ZT12時間點。

表2 主體間效應(yīng)的檢驗（因變量:針刺組MAP4）

圖4 不同時間點針刺對MAP4的調(diào)整幅度

3 討論

HSP27 蛋白是HSP 亞家族中的重要一員，在生物體內(nèi)參與多種復(fù)雜的功能活動，并反映出不同的生物學(xué)效應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有細胞保護作用。磷酸化的HSP27 可能介導(dǎo)血管緊張素II 與血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞的骨架重建和遷移，并且具有促進微絲形成和穩(wěn)定黏著斑的作用，這對促進細胞遷移有著重要作用[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎早期，氧化應(yīng)激損傷降低了細胞骨架的穩(wěn)定性，同時HSP27 蛋白及其磷酸化蛋白被激活，從而發(fā)揮對胰腺細胞骨架穩(wěn)定性的保護作用[21]。各種對細胞有害的應(yīng)激環(huán)境能夠誘導(dǎo)細胞骨架的重組或破壞，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使HSP27 發(fā)生磷酸化，磷酸化的HSP27 參與調(diào)控細胞骨架重組，穩(wěn)定細胞骨架結(jié)構(gòu)[22]。也有研究認為，HSP27 的磷酸化主要受蛋白激酶D（PKD）的激活，從而發(fā)揮對缺血性損傷后的神經(jīng)保護作用[23]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在ZT12 和ZT16 時間點復(fù)制佐劑型關(guān)節(jié)炎疼痛模型，導(dǎo)致這兩個時間點大鼠穴區(qū)皮膚中HSP27 蛋白表達應(yīng)激性增加，針刺治療后能明顯降低ZT12 時間點HSP27 蛋白表達；在不同時間點針刺對HSP27的蛋白調(diào)整作用不同，其中在ZT16時間點針刺對該蛋白表達的調(diào)整幅度大于ZT12時間點。

MAP4 是微管相關(guān)蛋白的一種，具有調(diào)節(jié)微管排列、促進微管組裝、交聯(lián)微管和肌動蛋白等生理功能。MAP4 包被在微管外部時，微管蛋白亞單位不能脫離微管的末端，從而起到了穩(wěn)定微管的作用。MAP4 既可以獨立引起微管解聚，又能協(xié)同相關(guān)蛋白通道共同作用于微管，影響細胞骨架重構(gòu)。體內(nèi)外研究均顯示MAP4 能增強微管蛋白聚合和整體微管的穩(wěn)定性[24]。MAP4主要通過兩種途徑促進微管的穩(wěn)定性：①通過捆綁微管并促進對外力的抵抗；②通過結(jié)合微管和空間阻斷主動分解微管的蛋白質(zhì)[25]。MAP4 的磷酸化誘導(dǎo)MAP4從微管中脫離，使微管細胞骨架失穩(wěn)。缺氧導(dǎo)致心肌細胞微管結(jié)構(gòu)遭到破壞并激活p38MAPK 信號傳導(dǎo)通路，使MAP4磷酸化增加，從而誘導(dǎo)微管細胞骨架解聚并降低細胞活性[26-27]。炎性條件下，肺內(nèi)皮屏障功能障礙使MAP4 磷酸化伴隨p38MAPK 信號途徑的激活而增加，從而誘導(dǎo)微管解聚，使肺血管通透性增高[18]。本課題組的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ZT12和ZT16時間點復(fù)制佐劑型關(guān)節(jié)炎疼痛模型，導(dǎo)致ZT12時間點大鼠穴區(qū)皮膚中MAP4 蛋白表達應(yīng)激性增加；在不同時間點針刺對MAP4 的蛋白調(diào)整作用不同，其中在ZT16 時間點針刺對該蛋白表達的調(diào)整幅度大于ZT12時間點。

HSP27 和MAP4 在細胞骨架的調(diào)控過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。細胞化學(xué)信號的產(chǎn)生依賴于細胞骨架將機械信號傳導(dǎo)至細胞核，成纖維細胞作為應(yīng)力細胞，能感知和傳導(dǎo)機械力刺激，將其轉(zhuǎn)化為力學(xué)信號從而導(dǎo)致細胞產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)[28-29]。成纖維細胞的這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用得力于其細胞骨架的感受器作用，細胞骨架是一組由纖維結(jié)構(gòu)組成的蛋白網(wǎng)狀支架，由微絲、微管及中間絲構(gòu)成。機械力作用于成纖維細胞引起的細胞骨架重構(gòu)及形態(tài)變化參與信號傳導(dǎo)。針刺作用屬于物理力學(xué)刺激的一種，能夠?qū)⒋碳ぷ饔棉D(zhuǎn)換為生物化學(xué)信號，對成纖維細胞骨架、形態(tài)以及其相關(guān)生長因子進行調(diào)節(jié)[30-31]。已有研究表明，針刺對成纖維細胞骨架重構(gòu)及其骨架蛋白具有明確的調(diào)整作用，且這種效應(yīng)具有時間差異[15]。本研究在前期不同時間點針刺對鎮(zhèn)痛效應(yīng)不同的研究基礎(chǔ)上[7-9,15]，選擇針灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有明顯差異的兩個時間點，即ZT12和ZT16時間點，通過比較這兩個時間點針刺對穴區(qū)皮膚中HSP27 和MAP4 蛋白表達量的差異，探討其對成纖維細胞骨架調(diào)控的相關(guān)原理，以期揭示針刺時間效應(yīng)的始動機制，為針刺鎮(zhèn)痛的擇時治療提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，在ZT12和ZT16兩個時間點，針刺在相同時間點不同組間以及不同時間點相同組間，對HSP27 和MAP4 蛋白表達均具有不同的調(diào)節(jié)作用，并且在ZT16時間點，針刺對HSP27、MAP4蛋白表達量的調(diào)整作用均大于ZT12時間點。因此本課題組推測，針刺通過對穴區(qū)HSP27、MAP4 蛋白表達的調(diào)整，從而影響成纖維細胞骨架重構(gòu)的改變，在不同時間點ZT12、ZT16針刺對穴區(qū)成纖維細胞骨架重構(gòu)的不同調(diào)控效應(yīng)，可能與這兩個時間點針刺對骨架蛋白表達相關(guān)信號分子HSP27、MAP4 的調(diào)整作用不同有關(guān)，從而發(fā)揮不同的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。