不同激素對(duì)烏腺金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的影響

于風(fēng)馳,李自強(qiáng),李昊陽,王鐸森,劉曉丹

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

1 引言

金絲桃屬(HypericumL.)中特有的活性成分金絲桃素，具有明顯的抗病毒、抗抑郁作用，同時(shí)可增強(qiáng)免疫力[1]；其中藥制劑也可作為獸藥。長白山地區(qū)具有豐富的野生金絲桃資源，主要是長柱金絲桃、短柱金絲桃和烏腺金絲桃，其中烏腺金絲桃在吉林省具有廣泛的分布。

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的天然活性成分為中草藥的可持續(xù)發(fā)展提供了一條新的途徑。多年來，對(duì)金絲桃素的需求持續(xù)攀升，國內(nèi)外有關(guān)金絲桃屬離體培養(yǎng)的研究也隨之大幅增加[1,2]。

本研究以金絲桃素含量較高的烏腺金絲桃為試材，探討不同激素配比對(duì)烏腺金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的影響，最終建立烏腺金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)體系?？蔀閷頌跸俳鸾z桃懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞資源。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

植物材料：烏腺金絲桃無菌苗。

主要試劑：MS培養(yǎng)基(青島海博)，2,4-D、6-BA 及KT等激素(上海綠葉)。

2.2 方法

2.2.1 外植體的獲得

在超凈工作臺(tái)中，將烏腺金絲桃無菌苗幼嫩的葉片進(jìn)行切割，由于無菌苗較小，切割時(shí)可以帶有部分莖段，長度約1 cm備用。

2.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

借鑒已報(bào)道的文獻(xiàn)[3,4]，采用4種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合：1號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+ KT 0.4 mg/L；2號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+6-BA 0.4 mg/L；3號(hào)：2,4-D 1.2 mg/L+ KT0.2 mg/L；4號(hào)：2,4-D1.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。將上步準(zhǔn)備的外植體接種到1～4號(hào)培養(yǎng)基中，每瓶接種10個(gè)左右材料，每種培養(yǎng)基接種10瓶，(25±1)℃，避光培養(yǎng) 15 d后，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，確定最佳的激素配比。誘導(dǎo)率=(愈傷總數(shù)/外植體總數(shù))×100%。

2.2.3 愈傷組織的增殖

考慮不同分裂素的激活作用不同，設(shè)計(jì)6種增殖培養(yǎng)基激素組合：5號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.2 mg/L；6號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.2 mg/L；7號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.4 mg/L；8號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L；9號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.6 mg/L；10號(hào)：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.6 mg/L。將上步形成的愈傷切割成0.5 cm2的小塊，接種到5～10號(hào)培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種5塊，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每15 d轉(zhuǎn)接一次。接種 6周后，統(tǒng)計(jì)增殖率。分析不同激素配比對(duì)愈傷增殖的影響，確定烏腺金絲桃愈傷的增殖最適培養(yǎng)基配方。增殖倍數(shù)=轉(zhuǎn)瓶后愈傷鮮重/轉(zhuǎn)瓶前愈傷鮮重。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同激素組合對(duì)烏腺金絲桃愈傷組織的影響

將烏腺金絲桃無菌苗的葉片接種到不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，(25±1)℃，培養(yǎng) 15 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1。

表1 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

當(dāng)2,4-D濃度水平一致時(shí)時(shí)，細(xì)胞分裂素KT對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯好于6-BA。而對(duì)比不同濃度生長素2,4-D對(duì)誘導(dǎo)率的影響，發(fā)現(xiàn)濃度為0.6 mg/L時(shí)形成的愈傷組織質(zhì)地疏松且生長快，僅有少量褐化，更適合烏腺金絲桃愈傷組織的誘導(dǎo)(圖1)，其中1號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，最終確定最佳激素配比即為2,4-D 0.6mg/L +KT 0.4 mg/L。

圖1 烏腺金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

3.2 不同激素組合對(duì)烏腺金絲桃愈傷組織增殖的影響

在不同增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。激素組合為2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L時(shí)，愈傷組織的增殖倍數(shù)最高，達(dá)7.2。在2,4-D濃度相同的條件下，兩種細(xì)胞分裂素的濃度由0.2 mg/L增加至0.4 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)均明顯增大；對(duì)比相同濃度水平下KT與TDZ對(duì)增殖倍數(shù)的影響，TDZ的效果更好。當(dāng)兩種細(xì)胞分裂素的濃度均提高到0.6 mg/L時(shí)，愈傷組織的增殖率反而下降。最終確定8號(hào)培養(yǎng)基為最佳激素組合，即2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L。

表2 不同激素比對(duì)愈傷組織增殖的影響

4 討論

外源激素的種類與濃度對(duì)不同植物愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作金絲桃屬植物愈傷的誘導(dǎo)和增殖中，激素的組合和配比差異顯著。李景原2000年對(duì)貫葉金絲桃細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激素配比為2,4-D1 mg/L+NAA1 mg/L時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá)92.86%[5]；而許明淑2001年對(duì)貫葉金絲桃研究結(jié)果表明，激素配比為2,4-D2.0 mg/+6-BA2.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)形成愈傷組織最多[6]；張娜在2005年對(duì)貫葉連翹進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基為MS+2,4-D 0.2 mg/L+KT0.02 mg/L時(shí)，效果最好[7]。于曉坤2012年在貫葉連翹愈傷組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，KT 濃度為0.02 mg/L時(shí)適宜增殖[8]。

本試驗(yàn)以金絲桃素含量較高的烏腺金絲桃為材料，成功建立其愈傷組織培養(yǎng)體系；以此為出發(fā)材料，目前項(xiàng)目組正在進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系研究，以期為工業(yè)化大規(guī)模合成并生產(chǎn)金絲桃素提供理論參考。