牛乳酪蛋白及其水解物的納米金熒光增強檢測方法

薛海燕，薛麗歡，賀寶元，樊嬌嬌，李晶瑩

（陜西科技大學(xué)a.食品與生物工程學(xué)院，b.輕工科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021）

0 引 言

酪蛋白（Casein,簡稱為CN）是乳中含量最高的蛋白質(zhì)[1]，是一類富含賴氨酸的結(jié)合蛋白。酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸，其經(jīng)水解可產(chǎn)生如ACE 抑制肽、抗氧化肽、抗疲勞肽等功能肽段[2]。但嬰幼兒難以消化酪蛋白，隨著市場配方嬰幼兒乳粉的價格增高，部分廠商在乳清粉中摻入水解酪蛋白，會對嬰幼兒的健康造成損害。目前國內(nèi)外研究酪蛋白檢測技術(shù)有相關(guān)報道，程濤、孫艷波等人采用雙縮脲法測定牛乳中酪蛋白含量[3]，將其作為一種判定牛乳質(zhì)量的指標；J Belloque[4]等人用31P-NMR 技術(shù)測定牛奶中酪蛋白含量；B Vallejo[5]等用毛細管區(qū)帶電泳技術(shù)分離和測定牛乳中的主要酪蛋白和乳清蛋白；G Anguita等[6]用競爭ELISA 檢測羊乳及羊乳制品中摻雜的牛乳，使用的是牛乳β-酪蛋白單克隆抗體，可檢測出摻雜率在0.5%～25%范圍的樣品。而關(guān)于酪蛋白及其水解物的檢測方法報道較少，因此，需建立一種操作簡單，快速準確且靈敏度高的檢測方法。

近年來，納米金表面增強熒光(surfaceenhancedfluorescence, SEF)的研究越來越受到人們的重視。在熒光檢測分析中常用異硫氰酸熒光素( FITC) 作為熒光探針，因其量子產(chǎn)率高，有較好的光穩(wěn)定性和較低溫度系數(shù)[7]。在堿性條件下，F(xiàn)ITC 分子中的異硫氰基可直接與蛋白分子中的氨基( 主要為賴氨酸的ε-NH2) 經(jīng)碳?；磻?yīng)形成硫碳氨基鍵，實現(xiàn)熒光蛋白標記[8]。目前主要利用納米粒子淬滅熒光對核酸、蛋白質(zhì)進行定性定量研究,但是通過液相中的熒光增效行為的研究很少。司民真等[9]在溶液中利用金屬銀納米粒子可以增強染料分子的熒光, 并研究了銀納米粒子電性和熒光增強的關(guān)系。余林海[10]等研究表明納米金對熒光素的熒光效率具有增強作用, 其增強效果取決于納米金的尺寸大小和濃度。李慧等[11]研究基于核酸雜交的原理建立了納米銀聚合探針的檢測方法，實現(xiàn)了熒光信號放大的作用，并成功應(yīng)用于人IgE 的高靈敏分析檢測。張曉紅等[12]利用DNA 聚合和銀納米結(jié)構(gòu)的增強熒光效應(yīng)檢測凝血酶的檢測范圍為0～1.0 μmol/L，檢測限是9.3 nmol/L。王睿等[13]通過條件優(yōu)化建立納米金-羅丹明B體系的熒光增強法測定硫酸阿米卡星的線性范圍為7.80×10-6～1.25×10-4mol/L，檢出限為2.2×10-6mol/L。賈佳等[14]建立食品中痕量TBHQ 的金納米粒子熒光增強測定法，在最佳檢測條件下金納米熒光強度與TBHQ 在0.13～1.7 mg/kg 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.995，檢出限為0.12 mg/kg。Park 等[15]通過靜電吸引與Cy3 共軛的適體固定在納米金上，實現(xiàn)熒光發(fā)射增強，其熒光強度變化與凝血酶濃度從10 μmol/L 到10 pmol/L成正比。Nam 等[16-18]以檢測抗體和巰基寡核苷酸修飾納米金形成納米金探針，通過銀染反應(yīng)檢測蛋白質(zhì)含量，或者用熒光基團修飾納米金探針上的巰基寡核苷酸，通過熒光檢測測定蛋白質(zhì)含量。

本文利用金納米粒子的熒光增強作用，在其表面結(jié)合酪蛋白抗體，然后將FITC 標記于CN 分子游離的NH2（主要是賴氨酸的ε- NH2）特異性結(jié)合，二者結(jié)合后使體系熒光增強。原理如圖1 所示，當待檢物含有CN 時，競爭性地使體系熒光減弱，當待檢物不含有CN 時，外來抗原無法與酪蛋白抗體結(jié)合，從而使體系的熒光強度不發(fā)生變化。所以根據(jù)檢測熒光強度的變化可以實現(xiàn)對待測CN 及其水解物的檢測。

圖1 納米金熒光增強法檢測CN

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

牛乳酪蛋白，胃蛋白酶，胰蛋白酶均為美國sigma公司；30 nm 的金納米粒子，上海杰一生物技術(shù)有限公司；FITC，96 孔板，美國康寧公司；透析袋，上海源葉生物科技有限公司；生理鹽水，辰欣藥業(yè)股份有限公司；PEG 20000/6000，美國sigma公司。

1.2 實驗儀器

全波長功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；超濾儀，美國millipore 公司；酶標板（聚苯乙烯板）96孔，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；微型旋渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠；Smart系列超純水儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；移液槍，德國Brand公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CN-FITC 的制備及標記率檢測[19]

1.3.1.1 熒光標記牛乳酪蛋白

稱取牛乳酪蛋白20.0 g，溶于1 000 mL pH 9.5 的PBS緩沖液中，超聲30 min后于磁力攪拌器上攪拌1 h至酪蛋白完全溶解，向酪蛋白溶液中添加0.2 mg 的FITC，超聲30 min 后于磁力攪拌器上攪拌1 h，靜置于4 ℃冰箱中反應(yīng)24 h，調(diào)節(jié)其pH 至4.6，于4 ℃，5 000 r/min 離心30 min，3 次，棄去上清，除去沒有與酪蛋白結(jié)合FITC，將樣品再次溶解，通過1 ku 的超濾膜超濾再次去除殘留FITC，此過程重復(fù)3 次，使用透析袋透析24 h，每4 h 換一次透析液，寬度36 mm，MW：8 000-14 000，將所得樣品進行冷凍干燥后，保存于4 ℃的冰箱中。

1.3.1.2 熒光標記率的檢測

稱取3 mL 酪蛋白、FITC-酪蛋白溶液分別在280 nm、495 nm 處測吸光值，以酪蛋白溶液為空白對照組，均做三個平行。依相關(guān)公式計算FITC-酪蛋白的熒光標記率[20]。

F/P：FITC 與酪蛋白的比值，即每mg 酪蛋白所標記的μg FITC 的比值；

OD280 nm、OD495 nm：FITC-酪蛋白在波長為280 nm、495 nm 檢測的吸光光度值。

1.3.2 Gold-IgG 的制備

參照薛海燕等[21]的方法，取1 mL，濃度為5.0×10-10mol/L的膠體金溶液，0.1 mol/LK2CO3溶液調(diào)至最佳標記pH 為8.0，按最佳蛋白標記量加入抗體蛋白10 μL，漩渦振蕩，充分混勻后于4 ℃，10 000 r/min 離心15 min，3 次，棄上清，沉淀用免疫金稀釋液復(fù)溶至原體積的1/10，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Gold -IgG 和CN-FITC 最佳比例標記

將上述制備的gold-IgG 溶液中分別加入10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL casein-FITC 溶液，于37 ℃孵育1 h，在4 ℃，13 000 r/min 離心15 min，3 次，棄上清，沉淀用pH 為7.5，含有1%PEG 的PBS 緩沖溶液洗滌，平行實驗三次，確定最佳標記比例。

1.3.4 紫外可見吸收光譜表征

取納米金及標記好的Gold-IgG 和Gold-IgGCN-FITC 進行400～700 nm 紫外可見全波長掃描，觀察峰強度、峰位移及半峰寬的變化。

1.3.5 納米金熒光增強檢測方法的建立

1.3.5.1 酪蛋白檢測方法的建立

用pH為9.0的PBS分別配制0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL 的酪蛋白溶液，超聲30 min 后于磁力攪拌器上攪拌1 h 至酪蛋白完全溶解，吸取100 μL 添加于96 孔板進行檢測，使用全波長功能讀數(shù)儀測定其熒光強度。測定條件如下，激發(fā)波長為495 nm，掃描發(fā)射波長范圍為500～700 nm，電壓為400V，狹縫寬度均為10 nm。各相應(yīng)濃度抗原的RFU 值為B，以log10（B）值為縱坐標，以相應(yīng)濃度值為橫坐標，制作標準曲線，根據(jù)標準計算待測抗原濃度。

1.3.5.2 對酪蛋白胃腸水解物標準溶液的檢測

稱取1 mg/mL 的FITC-酪蛋白溶液一份，用6 mol / L HCl 將pH 調(diào)節(jié)至2.0，在37 °C 下孵育10 min，加入100 mg / mL 胃蛋白酶0.2 mL，于37 °C 下體外模擬消化震蕩1 h 后停止反應(yīng)，用2 mol / L 氫氧化鈉溶液將體系的pH 調(diào)節(jié)至7.0，加入100 mg/mL 0.12 mL 胰蛋白酶和脫氧膽酸鈉，于37 °C 勻速震蕩，取2 h后的胃腸消化液進行檢測。

1.3.6 重復(fù)性試驗

分別取3 個已知濃度的酪蛋白標準品及其胃腸水解物，按所建立的納米金熒光增強檢測法分別進行批內(nèi)、批間檢測的可重復(fù)性試驗。批內(nèi)試驗檢測，每個濃度設(shè)三個重復(fù)；批間試驗進行3 次獨立檢測，每次間隔10 d，計算所測得熒光的平均值和變異系數(shù)（CV）。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Origin 軟件作圖并用SPSS 9.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FITC 標記牛乳酪蛋白及熒光標記率的檢測

2.1.1 FITC-CN 的純化結(jié)果

圖2 FITC-CN體系游離熒光檢測

由圖2 可知，對FITC-CN 標記體系中游離熒光檢測可知，F(xiàn)ITC-CN 溶液經(jīng)過一次超濾后濾液中熒光強度為186.80 RFU，兩次超濾后濾液熒光強度單位為62.53 RFU，表明已除去大部分游離熒光素，3 次超濾后濾液的熒光強度明顯減少，為20.67 RFU，表明除去游離熒光素效果明顯。3 次超濾后透析，檢測其濾出液幾乎無游離熒光素的存在。表明超濾透析純化后FITC-CN 可用于后期實驗研究。

2.1.2 熒光標記率的檢測

FITC 可與酪蛋白中的氨基結(jié)合形成穩(wěn)定的共價鍵，從而實現(xiàn)對酪蛋白的熒光標記。由表1，根據(jù)標記率公式，測得F/P=1.35，在1-2 之間，由文獻[22]知，蛋白質(zhì)被充分標記，比較成功。

表1 FITC-CN不同波長條件下吸光光度值

2.2 紫外-可見吸收光譜表征結(jié)果分析

圖3 納米金顆粒標記前后紫外可見光光譜掃描圖

圖3 為納米金標記前后的紫外-可見全波長掃描，當金納米粒子連接上抗體IgG，體系的最大吸收波長由523 nm 紅移到530 nm，且峰寬基本無變化，說明gold-IgG 標記結(jié)果穩(wěn)定可靠；當最后連接上CN-FITC 后，由于金納米粒子和熒光素的吸收峰的重疊，而導(dǎo)致了紫外吸收峰明顯的變寬和紅移。M 等人研究表明金納米粒子由于表面等離子共振引起的紫外可見吸收峰寬，與大部分熒光分子供體都有較好的重疊[23]。紫外吸收峰的變化表明，一系列的生物分子都已經(jīng)連接了在金納米粒子上。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 抗原最佳量的選擇

圖4 不同濃度CN-FITC對體系熒光增強檢測

如圖4 所示，本實驗使用粒徑為30 nm 的納米金，在已標記好的Gold-IgG-CN-FITC 體系中，固定熒光素濃度為0.1 mg/mL，分別加入1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL 的CN，其引起熒光增強的臨界點分別為1、10、20 μg/mL。這證明粒徑相對較小的納米金對熒光增效的效果較好。結(jié)果如圖5 所示，隨著CN 濃度的增大，體系的熒光強度逐漸增強，當濃度達到30 μg/mL 時，體系熒光強度達到最大值，繼續(xù)增大抗原濃度，體系熒光強度逐漸減弱甚至猝滅，由此得出建立體系的最佳CN-FITC 濃度為30 μg/mL，即抗體∶抗原=1∶3。根據(jù)理論[24],熒光通常是發(fā)生在具有剛性結(jié)構(gòu)和平面結(jié)構(gòu)的電子共扼體系分子中,隨著電子共扼度和分子平面度的增加,熒光量子產(chǎn)率也將有很大程度的增加。熒光增強是指任何可以使某種給定熒光物質(zhì)的熒光強度增加的作用或任何可以使熒光量子產(chǎn)率增加的作用。在Gold-IgG-CN-FITC 體系中，一方面由于金納米粒子表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使體系的熒光強度增強；另一方面激發(fā)態(tài)復(fù)合物的存在也有效避免了分子間的碰撞,或加強了熒光分子的剛性結(jié)構(gòu),降低表面缺陷,從而增強了體系的熒光強度。

圖5 不同濃度抗原的納米金熒光增強法檢測

2.4 CN 標準曲線的建立

納米金熒光增強法檢測蛋白質(zhì)先是利用納米金可以與生物分子非共價結(jié)合的特性將抗體標記于納米金表面，然后再利用抗原抗體特異性反應(yīng)將CN-FITC 非共價結(jié)合，根據(jù)納米金熒光增強效應(yīng)，使標記體系熒光達到最大，最佳標記體系中加入待檢抗原，待測抗原和熒光標記抗原競爭與金標抗體結(jié)合，則體系熒光強度隨著待測抗原濃度的增加而降低，即呈反比。

圖6 納米金熒光增強法檢測CN

圖7 納米金熒光增強法檢測CN的標準曲線

2.5 酪蛋白胃腸水解物的檢測

稀釋5 份已知酪蛋白胃腸水解物濃度用納米金熒光增強法檢測，將兩者檢測值對比，檢測結(jié)果如表2，表明兩者基本一致，說明該方法可應(yīng)用于牛乳酪蛋白胃腸水解物的相應(yīng)檢測。

表2 酪蛋白胃腸水解物檢測

2.6 酪蛋白胃腸水解物標準曲線的建立

圖8 納米金熒光增強法檢測酪蛋白胃腸水解物

圖9 納米金熒光增強法檢測酪蛋白胃腸水解物的標準曲線

如圖8 圖9 所示，利用該方法檢測酪蛋白胃腸水解物繪制的標準曲線，隨著酪蛋白水解物濃度的增大，體系熒光強度逐漸減弱，并在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，如圖9 所示，線性方程為y= -0.67x+5.61，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 ，線性關(guān)系良好，該方法對酪蛋白胃腸水解物檢測限為0.2 μg/mL。

2.7 重復(fù)性實驗結(jié)果

各取3 個已知濃度的標準酪蛋白和酪蛋白胃腸水解物，分別做3 個組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)試驗，結(jié)果如表3 表4 所示，CN:批內(nèi)試驗變異系數(shù)為2.73%～4.33%，批間試驗變異系數(shù)為2.45%～4.56%；酪蛋白胃腸水解物：批內(nèi)試驗變異系數(shù)為3.30%～5.62%，批間試驗變異系數(shù)為3.06%～5.97%，均小于6%，表明所建立的納米金熒光增強競爭法對CN 及其胃腸水解物檢測均具有良好的可重復(fù)性。

表3 納米金熒光增強法檢測CN的重復(fù)性

表4 納米金熒光增強法檢測酪蛋白胃腸水解物的重復(fù)性

3 結(jié) 論

納米金標記對生物分子的活性影響較小，且能標記很大一部分生物分子，是非常理想的標記物。納米金具有獨特的理化特性，納米金標記蛋白質(zhì)一般是通過物理吸附標記的。標記原理是蛋白質(zhì)溶液在其pH值等于或稍高于該蛋白質(zhì)的等電點時呈現(xiàn)電中性,此時蛋白質(zhì)分子與納米金相互間的靜電作用較小,但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大,處于一種微弱的水化狀態(tài),較易吸附于納米金表面。納米金對蛋白質(zhì)等生物大分子有很強的吸附作用,而且這種吸附作用不會使其變性[25],因此在免疫分析方面有很好的應(yīng)用前景。

本研究中，納米金探針標記抗體的同時還標記了帶有熒光信號的蛋白分子，熒光探針捕獲檢測待測蛋白后與納米金探針結(jié)合形成競爭體系,從而將待測蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)化為對抗原標記熒光分子的檢測。這種方法通過一個納米金上有熒光標記的蛋白分子，將蛋白質(zhì)檢測信號放大,提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度，納米金承擔了信號放大載體的角色。

納米金熒光增強法檢測CN 標準曲線的線性范圍在0.2 μg/mL 到1μg/mL，R2為0.991，最低檢測限為0.2 μg/mL，而傳統(tǒng)的間接競爭ELISA 法檢測酪蛋白的檢測限為10 μg/mL，故該檢測方法對酪蛋白的檢測具有較低檢測限。原因可能是當抗體標記于納米金表面時，非特異性吸附顆粒比抗體單獨存在時更加易于洗去，從而降低了背景信號，即有利于獲得更高的檢測信號[26]。目前關(guān)于酪蛋白在胃腸生理環(huán)境條件下檢測其濃度尚未有研究報道，本實驗建立了一個初步的檢測方法，酪蛋白胃腸水解物標準曲線的線性范圍在0.2 μg/mL 到1 μg/mL，R2為0.998，最低檢測限為0.2 μg/mL。

綜上，以金納米粒子為基礎(chǔ)結(jié)合熒光光譜分析，實現(xiàn)了簡單且高靈敏度的對酪蛋白及其水解物的檢測。實驗結(jié)果表明，這種方法對酪蛋白及其水解物的檢測具有較低檢測限和相對較大的線性響應(yīng)范圍，本實驗對溶液中酪蛋白及其胃腸水解物的識別濃度低至0.2 μg/mL。我們選擇標準的生物分子識別體系來建立這種新的分析方法，但這種新型分析方法也適用于實際應(yīng)用中酪蛋白的高通量檢測。