乳清蛋白變性率測定方法研究進展

邵曉園，李高聰，盧興，彭麗，佟貴山，張軍

（1.黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心哈爾濱150500；2.黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室哈爾濱150080；3.雙城市君宇奶牛養(yǎng)殖有限公司哈爾濱150131）

0 引 言

乳清蛋白的變性會對乳制品產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。生產(chǎn)酸奶時，殺菌處理會導致部分乳清蛋白變性，改變酸奶的硬度、黏度和組織狀態(tài)，還可通過防止乳清析出，從而改善酸奶的品質(zhì)，與酸奶的質(zhì)量具有顯著的相關(guān)性[3-5]。在消毒奶生產(chǎn)過程中，乳清蛋白變性會使一些營養(yǎng)成分損失，如免疫球蛋白免疫活性喪失、過氧化物酶活性喪失，降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[6]。生產(chǎn)干酪時，熱處理溫度升高，乳清蛋白變性率增加，一方面會提高奶酪產(chǎn)量，另一方面也會提高奶酪的營養(yǎng)價值[7]。乳清蛋白變性程度會嚴重影響乳制品中營養(yǎng)成分的生物利用，從而影響乳制品的品質(zhì)。因此，完善乳清蛋白變性率測定方法是極為重要和必要的，對提高我國乳品質(zhì)量具有非常重要的意義。

1 乳清蛋白變性的機理

乳清蛋白變性是指蛋白質(zhì)特有的二級、三級結(jié)構(gòu)的變化，是原來多肽鏈因外界因素疏松或打開，其一級結(jié)構(gòu)中共價鍵連接的肽鏈完好，并未發(fā)生斷裂[8]。蛋白質(zhì)變性過程包括兩個階段：第一，當外界溫度達到60 ℃時，原本多肽鏈的折疊結(jié)構(gòu)疏松或打開，導致變性反應(yīng)發(fā)生；第二，多肽鏈打開后變得越發(fā)活躍，容易與其他乳清蛋白或者是酪蛋白膠粒結(jié)合[9]。例如：β-Lg 在發(fā)生變性時，隨著其三級結(jié)構(gòu)展開，使得-SH暴露在外。由四個二硫鍵連接的α-la 在發(fā)生變性時，Cys6-Cysl20 之間的二硫鍵最先被破壞[10]。熱處理是使乳清蛋白發(fā)生變性的重要因素，此外pH 值、離子強度、基質(zhì)等也都會導致乳清蛋白變性[11]。

2 乳清蛋白變性率測定方法

乳清蛋白變性率測定的基本原理是測定變性前、后乳清蛋白質(zhì)含量差，通過含量差占變性前含量的百分比求得?？梢姡淇煽啃约胺奖阈酝耆Q于乳清蛋白質(zhì)的測定方法。

2.1 凱氏定氮法（國標法）

凱氏定氮法的基本原理是：通過測定物質(zhì)中的氮含量來估算物質(zhì)的總蛋白質(zhì)含量。它于1833 年由丹

麥化學家凱道爾提出。目前國標使用凱氏定氮法來測定乳清蛋白變性率，首先是將乳樣離心去除脂肪，再用1 mol/L 的HCl 離心去沉淀，所得的上清液（未變性的乳清蛋白溶液）加催化劑反應(yīng)、蒸餾，餾出液內(nèi)加硼酸后使用鹽酸滴定，根據(jù)消耗酸的量計算未變性乳清蛋白含量，利用原料乳與熱處理乳的乳清蛋白含量之差計算變性率[12]。計算公式如下：

凱氏定氮法整個實驗需要的時間非常長、實驗操作復雜、試劑消耗量大、只能測定樣品中的總蛋白質(zhì)，不能測定單一蛋白成分，不能進行大批量樣品測定[13]。但是因其測定結(jié)果準確，穩(wěn)定，可作為蛋白質(zhì)含量檢測的標準，用以驗證其他檢測方法的準確性。

2.2 色譜法

2.2.1 快速蛋白液相色譜法（FPLC）

1985 年Manji[14]提出了快速蛋白液相色譜法（Rapid Protein Liquid Chromatography，F(xiàn)PLC），用于測定乳清蛋白變性。其原理是：乳清蛋白中的每一種蛋白經(jīng)FPLC 分離后，在280 nm 處測定吸光度值（OD值），根據(jù)OD 值計算蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)熱處理后未變性乳清蛋白濃度會發(fā)生變化，在熱處理后各種乳清蛋白標準峰面積（SPA）和原料乳中乳清蛋白的SPA 比較，就可得出乳清蛋白變性率。計算公式參照公式（1）。FPLC 法重復性好，且迅速方便，能定性定量測定每一種乳清蛋白的變性率，克服了凱氏定氮法僅能測定蛋白變性總量的缺點[15]。

2.2.2 反高效液相色譜法（RP-HPLC）

反高效液相色譜法（RP-High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）可以對乳中未變性的乳清蛋白進行分離并定量測定?；痉椒樵先榛蚣訜崛榻?jīng)離心脫脂后，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 至4.6 沉淀酪蛋白和變性的乳清蛋白，經(jīng)離心或過濾除去沉淀后得到未變性乳清蛋白，再經(jīng)0.45 μm 尼龍膜過濾，即可上樣測定。乳清蛋白變性百分數(shù)的計算和FPLC 法相同。王浩等人[16]使用RP-HPLC 對牛奶及其乳制品中7 種蛋白成分進行分離，解決了乳制品加工后變性蛋白含量測定不準確的問題。朱鑫鑫[17]等人用此方法來測定不同乳樣中未變性乳清蛋白含量，結(jié)果表明此方法能將4 種乳清蛋白分離并且定量準確，適合應(yīng)用于乳清蛋白的定量和定性。 RP-HPLC 與凱氏定氮法相比較準確、快速，但所需標準品和儀器價格昂貴，檢測成本較高。

2.3 分光光度法

2.3.1 雙縮脲法

雙縮脲法的原理是：脲在180 ℃時脫氨生成雙縮脲，與Cu2+形成紫紅色復合物，顏色深淺與蛋白含量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，對乳清蛋白樣品的吸光度值進行檢測，與標準曲線進行對比便可找出蛋白質(zhì)的濃度[18]。在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。路純明[19]等人采用正交實驗優(yōu)化了雙縮脲法的測定條件，進而測定酸奶、牛奶中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明該方法測定結(jié)果準確，且與凱氏定氮法的相對誤差僅為3%。王振華[20]等人在雙縮脲法的基礎(chǔ)上添加過濾步驟，對牛乳中未變性乳清蛋白進行測定，結(jié)果表明該方法精確度、準確度、回收率等均較高。雙縮脲法測試時間短，過程操作簡單，可大批量測定，但同時也存在準確度、靈敏度較差，測定蛋白質(zhì)范圍只有1～20 mg 等缺點[21]。

2.3.2 考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍法的基本原理是：考馬斯亮藍（G-250）溶液與乳清蛋白反應(yīng)生成藍色復合物，測定乳樣品在595 nm 處的OD 值，與標準曲線進行對比便可找出蛋白質(zhì)的濃度[22]。1976 年Bradford[23]首次提出了使用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。聶昌宏[24]等用此方法對牛乳中未變性乳清蛋白和總蛋白含量進行了測定，結(jié)果表明在0.005～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)的OD 值線性關(guān)系（r=0.9995）良好，RSD 為2.03%，驗證了該方法可以對未變性乳清蛋白和總蛋白進行準確測定?？捡R斯亮藍法靈敏度高，檢測下限達1 ug 左右，測定過程需要的時間短，操作簡便，而且穩(wěn)定性比較好。

2.3.3 Lowry法

1921 年Folin 創(chuàng)造了Folin－酚試劑法來測定蛋白質(zhì)，但該法靈敏度低[25]。1951 年，Lowry 改進Folin 法，發(fā)現(xiàn)在堿性環(huán)境下，肽鍵與Cu2+形成的螯合物與Folin試劑可產(chǎn)生藍色混合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量正相關(guān)[26-27]，通過測得的O.D 值計算含量。Lowry 法具有操作簡單、靈敏度高的優(yōu)點，缺點是受多種因素干擾，需要購買試劑盒，需要的資金多，不適應(yīng)于大批量樣品測定[28]。

2.3.4 二喹啉甲酸法（BCA）

二喹啉甲酸法的基本原理是：蛋白質(zhì)與BCA 試劑可生成有色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，在562 nm 下測定其吸光度值，根據(jù)試樣的吸光度值在對應(yīng)的標準曲線上找出對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度[29]。在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。BCA 法的抗干擾能力明顯強于凱氏定氮法，靈敏度高，檢測下限達0.5 ug[1，30]。此外，BCA 法具有速度快、結(jié)果準確、操作簡單、所用試劑較少、分析成本低廉等優(yōu)點。

2.4 其他方法

2.4.1 差示掃描量熱法（DSC）

許多研究者應(yīng)用差示掃描量熱法（DSC）研究了乳清蛋白的變性問題[15]。蛋白質(zhì)的變性焓變通過公式△H=4RTD2-△TD1/2來計算，式中：TD為變性溫度，是熱吸收峰的半峰寬，R 是氣體常數(shù)，據(jù)此我們可以求得蛋白變性率（%），即：

在測定蛋白質(zhì)濃度為2%～7%的溶液時，此方法存在重復性差，定量困難的缺點，不適用于在乳品中進行乳清蛋白變性的定量測定。但蛋白質(zhì)濃度高于10%時，DSC 方法不僅能夠得到較為準確的變性溫度，而且能得到變性百分比結(jié)果[15]。

2.4.2 乳清蛋白氮指數(shù)法（WPNI）

乳清蛋白氮指數(shù)法（Whey Protein N Index，WPNI）的原理是：通過對濁度（420 nm 下乳清上清液的透明度）的迅速測定，與對應(yīng)的標準曲線進行對比，再通過計算得到WPNI 值，比較原料乳和熱處理乳的WPNI 值得到乳清蛋白的變性率。由1947 年Harland首次提出并經(jīng)Leighton 等修正后應(yīng)用于乳清蛋白變性的測定中。王婷婷[31]等人采用在蛋白質(zhì)溶液中加鹽酸導致溶液混濁，利用420 nm 處的吸光度值表征變性程度，結(jié)果表明該方法具有測定迅速、方便的優(yōu)點，但是與凱氏定氮法比較，重復性差誤差稍大，不適用于對乳清蛋白變性進行精確測定[32]。

2.4.3 SDS電泳法

SDS 電泳法的基本原理是：十二烷基硫酸鈉（SDS）可破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性[19]。乳清蛋白變性后分子量會發(fā)生較大變化，電遷移率也會隨之發(fā)生較大變化，再通過電泳和光密度掃描，對照原料乳和熱處理乳計算乳清蛋白變性率。它由Shapiro[33]于1967 年建立，可用于分離各種蛋白質(zhì)和核苷酸[34-35]。SDS 電泳法不能對免疫球蛋白進行定性定量測量，因而對總蛋白的測定結(jié)果產(chǎn)生影響，另外對儀器設(shè)備要求較高，結(jié)果需用Bandscan 軟件后處理，誤差較大，測定所需時間長[36]。

2.5 方法整理對比

以上對常見乳清蛋白測定方法進行了詳細介紹，各方法均有其自身特點，現(xiàn)將其優(yōu)缺點做出整理，如表1所示。

表1 乳清蛋白測定方法比較

3 展 望

乳清蛋白變性率是乳制品加工過程中品質(zhì)控制的一項關(guān)鍵指標，其測定方法有很多種，凱氏定氮法作為經(jīng)典方法，測定結(jié)果準確，所以GB 5009.5-2010采用此方法，但操作復雜、耗時長，可作為基準檢測使用；色譜法，由于可以分離各種蛋白質(zhì)并進行定量，所以該法針對性更強，但成本很高。比較研究結(jié)果顯示，色譜法測定速度快，實用價值和應(yīng)用前景比較明朗，且RP-HPLC 法和FPLC 法都與凱氏定氮法結(jié)果有很好的一致性[37]。差示掃描量熱法、WPNI 法具有方便、快速的特性，但是測定結(jié)果精確度差，應(yīng)用上受到限制。分光光度法是通過測定樣品的吸光度值來計算變性率，操作相對簡單且測定時間短，但需要完成顯色反應(yīng)過程，所以顯色劑選擇成為關(guān)鍵，要求選擇性好、靈敏度高（ε＞104）、化學組成和性質(zhì)穩(wěn)定、顯色劑和產(chǎn)物有明顯的顏色差（Δl＞60nm）等條件，因此，對分光光度法的優(yōu)化及開發(fā)有廣闊的發(fā)展空間，是今后蛋白質(zhì)測定方法研究的重要方向。