液相色譜-串聯(lián)原子熒光光譜法測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的不確定度評(píng)定

劉娜，陳颯

（陜西中檢計(jì)量測(cè)試技術(shù)有限公司，西安 710068）

砷廣泛存在于地殼、土壤、海水、河水、大氣及食物中，極少以單質(zhì)狀態(tài)存在，幾乎所有物質(zhì)中都含有砷。砷是類金屬元素，它的毒性及某些性質(zhì)與重金屬相似，所以也被列入重金屬污染物范圍內(nèi)。砷的毒性與它的化學(xué)性質(zhì)與離子存在價(jià)態(tài)有關(guān)。不同形態(tài)的砷化合物，其毒性差別較大，單質(zhì)砷不溶于水，因此人體攝入后幾乎不被吸收，完全排出，通常無(wú)害；有機(jī)砷，除砷化氫衍生物外，一般毒性較弱；無(wú)機(jī)砷中三價(jià)砷對(duì)細(xì)胞毒性最強(qiáng)，如As2O3，AsCb，H3AsO3，AsH3等化合物，均具有劇烈毒性；五價(jià)砷毒性較弱，在人體內(nèi)被還原轉(zhuǎn)化為三價(jià)砷后，才能發(fā)揮其毒性作用。人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)機(jī)砷化物容易被人體吸收。除了大量攝入時(shí)的急性中毒外，長(zhǎng)期少量地?cái)z入砷也會(huì)有致癌的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。2017年10 月27 日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單，砷和無(wú)機(jī)砷化合物列為一類致癌 物［3］。水生生物由于其生活習(xí)性易于富集高濃度的砷，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品品質(zhì)受到影響。因此更受到大家的關(guān)注［4-7］。

隨著我國(guó)監(jiān)管控制逐漸規(guī)范化，GB2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》［8］對(duì)水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷提出了明確的限量要求，規(guī)定水產(chǎn)品（魚類除外）中無(wú)機(jī)砷限量為0.5 mg／kg。因此檢測(cè)水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的含量具有重要的意義和作用。

目前無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法主要有兩種，一種是采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ICP-MS），通過(guò)液相色譜柱對(duì)樣品中多種形態(tài)的砷進(jìn)行分離，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定，此方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，但電感耦合等離子體質(zhì)譜儀價(jià)格高昂，運(yùn)行成本也相對(duì)較高，而且此方法檢測(cè)限量較之原子熒光光譜法略差；另一種是采用高效液相色譜-原子熒光光譜儀聯(lián)用技術(shù)（HPLC-AFS），前處理方式相同，利用原子熒光光譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。原子熒光光譜儀均為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)，價(jià)格相對(duì)便宜，普通檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室均有配置，且此類設(shè)備靈敏度極佳，檢出限優(yōu)于HPLC-ICP-MS一個(gè)數(shù)量級(jí)之多。缺點(diǎn)是有時(shí)儀器運(yùn)行不夠穩(wěn)定，平行性不夠［9-10］。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GB 5009.11-2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》［11］中，對(duì)兩種方法均允許使用。筆者依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)使用液相色譜聯(lián)用原子熒光光譜儀平行檢測(cè)了水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的含量，對(duì)整個(gè)測(cè)量過(guò)程中所有不確定度的來(lái)源進(jìn)行了分析，對(duì)各個(gè)不確定的分量進(jìn)行了評(píng)估和合成［12-13］，明確了測(cè)定結(jié)果不確定度和主要來(lái)源，對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度具有一定意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

原子熒光形態(tài)分析儀：SA50 型，配備有液相色譜部分和原子熒光反應(yīng)與檢測(cè)部分，北京吉天儀器有限公司；

色譜柱：PRP-X100 型，250 mm×4 mm，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子天平：BSA224S 型，感量為0.000 1 g，德國(guó)賽多利斯公司；

離心機(jī)：Sigma 3 K15 型，德國(guó)西格瑪公司；

pH 計(jì)：STARTER 3100 型，美國(guó)奧豪斯公司；

烘箱：Venticell 11 型，德國(guó)MMM 公司；

有機(jī)濾膜：孔徑為0.45 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

C18小柱：BOND Elut C18型，500 mg，6 mL，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

磷酸二氫氨、氫氧化鉀、氨水：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硝酸、鹽酸：光譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司；

正己烷：色譜純，美國(guó)Fisher 公司；

三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為TPIV-CGAS(3)1-1，1 000 μg／mL，美國(guó)inorganic 公司；

五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為TPIV-CGAS(5)1-1，1 000 μg／mL，美國(guó)inorganic 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)GB 5009.11-2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》，使用液相色譜聯(lián)用原子熒光光譜儀平行檢測(cè)水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的含量。

1.3 樣品處理

稱取1.0 g 經(jīng)食品勻漿機(jī)粉碎均勻的海螃蟹樣品，置于50 mL 塑料離心管中，加入0.15 mol／L 的稀硝酸20 mL，封口，預(yù)消解過(guò)夜（約15 h）。將樣品置于90℃烘箱中熱浸提2.5 h，每半小時(shí)振搖1 min。冷卻至室溫，置于離心機(jī)中以8 000 r／min 離心15 min。取上清液5 mL，加入5 mL 正己烷，振搖1 min，置于離心機(jī)中以8 000 r／min 離心15 min，棄上層正己烷，再加5 mL 正己烷重復(fù)萃取一次。取下層清液，過(guò)孔徑為0.45 μm 的有機(jī)濾膜，用C18小柱凈化后上機(jī)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)學(xué)模型

在生物體內(nèi)和樣品前處理過(guò)程中，三價(jià)砷與五價(jià)砷可以相互轉(zhuǎn)化，三價(jià)砷相對(duì)比較穩(wěn)定，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，如單獨(dú)測(cè)定三價(jià)砷或五價(jià)砷，結(jié)果平行性并不好，回收率時(shí)高時(shí)低，大多數(shù)情況下，三價(jià)砷回收率偏高而五價(jià)砷回收率偏低，但總無(wú)機(jī)砷含量基本恒定［2］，因此檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定是以三價(jià)砷與五價(jià)砷加和總量計(jì)算，即討論無(wú)機(jī)砷總量的 檢測(cè)。

三價(jià)砷與五價(jià)砷均采用外標(biāo)法定量，按式(1)

計(jì)算含量：

式中：X——樣品中無(wú)機(jī)砷含量，mg／kg；

c——測(cè)定溶液中無(wú)機(jī)砷濃度，μg／L；

c0——空白溶液中無(wú)機(jī)砷濃度，μg／L；

V——試樣消解液總體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

1 000——換算系數(shù)。

總無(wú)機(jī)砷含量等于三價(jià)砷含量與五價(jià)砷含量之和。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

1.5 不確定度來(lái)源

無(wú)機(jī)砷含量測(cè)定結(jié)果不確定度的來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面：

（1）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的不確定度。包括樣品均勻性、天平稱重重復(fù)性、體積重復(fù)性和回收率重 復(fù)性。

（2）樣品溶液制備過(guò)程引入的不確定度。包括試樣質(zhì)量和浸提萃取引入的不確定度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度和稀釋所引入的不確定度。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。

具體來(lái)源詳見(jiàn)圖1。

圖1 不確定度主要來(lái)源圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品測(cè)定

依據(jù)GB 5009.11-2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》檢測(cè)6 個(gè)平行樣品，同時(shí)測(cè)定空白。平行檢測(cè)2 個(gè)空白得到空白結(jié)果均為0，故測(cè)得值即為檢測(cè)值，計(jì)算結(jié)果列于表1。

表1 無(wú)機(jī)砷平行測(cè)定結(jié)果

2.2 A 類不確定度

無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.001 1 mg／kg，平行測(cè)定次數(shù)n=6，則A 類不確定度：

A 類相對(duì)不確定度：

2.3 B 類不確定度

2.3.1 樣品溶液制備過(guò)程引入的不確定度urel(pre)

（1）樣品稱量引入的不確定度urel(m)。稱量使用萬(wàn)分之一天平，按均勻分布計(jì)算，不確定度u(m)=0.1／ 3 =0.058 mg，稱樣量平均為1 g，則樣品稱量引入的不確定度urel(m)=0.058／1 000=0.000 06。

（2）浸提萃取時(shí)引入的不確定度。所使用20 mL 單標(biāo)移液管（A 級(jí)）的校準(zhǔn)證書中給出不確定度為0.02 mL，則帶來(lái)的不確定度urel(V20)=0.02／20=0.001。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度urel(C)

（1）三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。濃度為1 000 μg／mL，證書給出的擴(kuò)展不確定度為4 μg／mL，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CAs3+)=4／2=2 (μg／mL)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CAs3+)=2／1 000=0.002。

（2）五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。濃度為1 000 μg／mL，證書給出的擴(kuò)展不確定度為4 μg／mL，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CAs5+)=4／2=2 (μg／mL)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CAs5+)=2／1 000=0.002。

（3）移液器引入的不確定度。使用100 μL 可調(diào)移液器，校準(zhǔn)證書給出不確定度為0.9 μL，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V100)=0.9／100=0.009。

將上述不相關(guān)分量不確定度進(jìn)行合成，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

（1）三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C1)。采用5 個(gè)不同濃度的三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定得到相應(yīng)的光譜強(qiáng)度值yi，測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。對(duì)其進(jìn)行一元線性擬合，得到直線方程。

表2 三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定數(shù)據(jù)

其中，S(y)=3 574.49，則u(C1)=0.490 01。

三價(jià)砷（As3+）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)=u(C1)／C1=0.086。

（2）五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C2)。采用5 個(gè)不同濃度的五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到相應(yīng)的光譜強(qiáng)度值yi，測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。對(duì)其進(jìn)行一元線性擬合，得到直線方程。

表3 五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果

擬合得到校正標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5 817.3x+3 345.9，則截距a=3 345.9，斜率b=5 817.3，R2=0.9 995。對(duì)試樣測(cè)定6 次，五價(jià)砷的平均濃度C2=4.1 μg／L，則n=6，標(biāo)準(zhǔn)曲線5 個(gè)點(diǎn)，重復(fù)測(cè)3 次，P=15，則五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(1)計(jì)算，其中，S(y)=8 889.37，則u(C2)=0.657 27。

五價(jià)砷（As5+）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)=u(C2)／C2=0.160 3。

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述各不相關(guān)不確定度分量進(jìn)行合成，得到合成不確定度：

u(X)=X·urel(X)=0.196×0.182 2=0.035 7 (mg／kg)。

2.6 擴(kuò)展不確定度和結(jié)果表示

水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷含量的擴(kuò)展不確定度，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度：

U(X)=2×u(X)≈0.071 mg／kg。

3 結(jié)語(yǔ)

液相色譜-串聯(lián)原子熒光光譜法測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的不確定度來(lái)源為重復(fù)性實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的不確定度；樣品溶液制備過(guò)程引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。由不確定度各分量的評(píng)估結(jié)果可看出，實(shí)驗(yàn)的各個(gè)因素均可對(duì)不確定度貢獻(xiàn)，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為主要分量，增加標(biāo)曲點(diǎn)數(shù)可以降低該不確定度分量。研究著眼于標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)際應(yīng)用，對(duì)不同儀器和分析對(duì)象也具有參考意義。