IGF-1調(diào)控RBM3表達抑制低溫應激誘導牦牛卵丘細胞凋亡

潘陽陽，王萌，芮弦，王立斌，何翃閎，王靖雷，馬睿，徐庚全，崔燕，樊江峰，余四九

IGF-1調(diào)控RBM3表達抑制低溫應激誘導牦牛卵丘細胞凋亡

潘陽陽1，王萌1，芮弦2，王立斌1，何翃閎1，王靖雷1，馬睿1，徐庚全1，崔燕1，樊江峰1，余四九1

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠，蘭州 730046）

【】探索動物機體遭受低溫應激及細胞冷凍過程中胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)與RNA結合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)之間的作用關系，及IGF-1參與哺乳動物細胞抑制低溫損傷的機制。體外培養(yǎng)牦牛卵丘細胞，采用實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot, WB )和免疫熒光技術檢測不同濃度（0、50、100、200 ng·mL-1）IGF-1和低溫應激（30℃、25℃）對RBM3表達影響。卵丘細胞經(jīng)最佳濃度IGF-1(100 ng·mL-1)和對照組(0 IGF-1)作用30 h后，低溫（30℃、25℃）應激8 h，比較RBM3表達水平。評估在低溫應激組、100 ng·mL-1IGF-1處理組和100 ng·mL-1IGF-1+RBM3抑制劑處理組，卵丘細胞25℃應激8 h后凋亡水平差異，并從基因和蛋白水平檢測3組卵丘細胞中凋亡相關基因Bax和Bcl-2的表達水平。(1) IGF-1作用卵丘細胞后RBM3基因和蛋白的表達水平顯著上升 (＜0.05)，其在100 ng·mL-1IGF-1處理組最高，免疫熒光檢測顯示100和200 ng·mL-1IGF-1處理組卵丘細胞胞核和細胞質均可檢測到RBM3，而0和50 ng·mL-1處理組，RBM3僅定位在細胞質。(2) 卵丘細胞經(jīng)受低溫應激時，RBM3的表達水平顯著增加，但其在30℃和25℃應激處理組差異不顯著；100 ng·mL-1IGF-1作用卵丘細胞30 h后，其再次接受25℃、8 h低溫應激，卵丘細胞中RBM3的表達水平顯著高于低溫應激前未經(jīng)IGF-1處理卵丘細胞中RBM3的表達水平，且該處理組卵丘細胞胞質和胞核均可檢測到RBM3。(3) 25℃應激后，100 ng·mL-1IGF-1處理組卵丘細胞的凋亡率為(15.94±2.03)%，顯著低于其在未經(jīng)IGF-1處理組和100 ng·mL-1IGF-1+RBM3抑制劑處理組中卵丘細胞的凋亡率，兩者分別為(25.86±1.09)%和(20.14±2.65)%，在100 ng·mL-1IGF-1處理組Bcl-2的表達水平顯著高于其余兩個處理組(＜0.05)，而Bax的表達水平顯著低于其余兩個處理組 (＜0.05)。RBM3參與牦牛卵丘細胞低溫應激調(diào)控，IGF-1可調(diào)控其在低溫應激中的表達水平，從而降低低溫誘導的卵丘細胞凋亡。本研究為揭示IGF-1和RBM3參與動物機體或細胞免受低溫損傷的分子機制提供了關鍵信息，為體細胞和生殖細胞冷凍技術的提高提供了理論依據(jù)。

牦牛；RNA結合基序蛋白3(RBM3)；胰島素樣生長因子(IGF-1)；低溫應激；細胞凋亡

0 引言

【研究意義】RNA結合基序蛋白3（RNA-binding motif protein 3，RBM3）作為冷誘導結合蛋白（cold- inducible RNA-binding protein，CIRP）家族成員之一[1]，動物機體和細胞受到低氧、低溫應激均可誘導其表達[1-2]，通過促進體內(nèi)其他蛋白的合成，維護應激條件下細胞的正常生理功能。研究哺乳動物細胞，尤其是高寒環(huán)境哺乳動物細胞經(jīng)受低溫應激時RBM3的表達變化，有助于揭示其參與動物機體低溫適應性的調(diào)控機制。通過生長因子的作用，探索其對細胞和機體RBM3表達的影響，降低低溫應激對細胞的損傷，對為優(yōu)化動物體細胞和生殖細胞的冷凍技術具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】動物機體內(nèi)RBM3可維持AU含量較高mRNAs的穩(wěn)定性[3]，通過誘導糖原合成激酶GSK-3β/ Wnt/β、Mark、絲氨酸/蘇氨酸激酶等信號通路維持其在細胞中的多能性，如細胞周期參與從G2到M期過渡的調(diào)節(jié)，胞內(nèi)相關microRNAs的調(diào)節(jié)[3-4]。哺乳動物的研究證實，RBM3可在多種細胞內(nèi)表達，但表達水平存在差異，表達水平增加時可參與細胞內(nèi)mRNAs翻譯和翻譯后的修飾的調(diào)節(jié)，進而提升細胞對不利環(huán)境刺激的耐受能力[5-6]，如細胞對低溫的耐受能力[7-8]。相關研究通過RBM3抑制劑咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）的作用證實其參與NF-κB p65信號調(diào)節(jié)，保護HeLa細胞免受中低溫誘導的細胞凋亡[9]。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF-1）作為細胞生長調(diào)控的關鍵因子，體外可通過多種途徑調(diào)節(jié)細胞生長與增殖，調(diào)控哺乳動物卵母細胞的成熟和早期胚胎發(fā)育[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1通過調(diào)控B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x（B-cell lymphoma/leukemia associated x protein，Bax）的表達水平抑制多種類型細胞凋亡[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期研究顯示IGF-1通過調(diào)控牦牛卵丘細胞HSP70、Bax和 Bcl-2表達，降低細胞凋亡率[14]。在牦牛卵母細胞體外成熟過程中加入不同濃度IGF-1，可增加成熟卵母細胞CIRP的表達，提升其冷凍-解凍后的發(fā)育能力[15]，但IGF-1提高卵母細胞冷凍后發(fā)育能力與細胞凋亡是否存在相關性未見報道。牦牛（）是我國青藏高原區(qū)域的典型家畜，長期生活在年均氣溫為0℃的壞境，低溫相關蛋白對其生理調(diào)控具有重要作用[16]?！緮M解決的關鍵問題】因此本研究以牦牛卵丘細胞為模型，分析IGF-1和溫度應激對RBM3表達的影響，評估RBM3的變化對細胞凋亡的調(diào)控，探索牦牛適應低溫調(diào)控的分子機制，為進一步闡明RBM3參與動物機體或細胞免受低溫損傷的分子機制提供了關鍵信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)粉、細胞培養(yǎng)級別犢牛血清、青霉素、鏈霉素購自于美國Gibco公司；透明質酸酶、胰蛋白酶、IGF-1、RBM3抑制劑CAPE購自美國 Sigma公司。Bax（ab32503）和Bcl-2（ab117115）抗體購自美國Abcam公司，RBM3（bs-5902R）抗體、熒光二抗bs-0295G-FITC）和普通二抗（bs-0294D、bs-0295G）購自北京博奧森生物公司。細胞總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒均購自美國OMEGA生物公司，DAPI及蛋白免疫印跡（Western blot，WB）所用試劑均購買于北京索萊寶生物公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 牦牛卵丘細胞分離培養(yǎng)

2018年10月至2019年9月，在青海西寧及甘肅臨夏家畜屠宰場，牦牛屠宰后立即采集卵巢，置于30—35℃預熱的含有雙抗的生理鹽水中，4 h內(nèi)帶回甘肅農(nóng)業(yè)大學牛羊胚胎工程中心。取出卵巢，用37℃生理鹽水清洗2—3次，用帶有12號針頭的注射器從直徑約為8 mm的卵泡中抽取卵泡液。將其轉移到培養(yǎng)皿中，置于體式顯微鏡下用撿卵針挑取胞質均一，含有3層以上卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合體（cumulus- oocyte complex，COC），無血清的PBS清洗3次后，用1%的透明質酸酶37℃消化5 min，體式顯微鏡下挑出卵母細胞，將含有卵丘細胞得懸液1 000 r/min離心5 min，用含有10% 血清的培養(yǎng)液通過離心再洗滌2次，懸浮細胞，計數(shù)后在37℃、5% CO2的條件下進行培養(yǎng)，每48 h換液一次。培養(yǎng)液為：DMEM/F12培養(yǎng)基+10%犢牛血清+100 U·mL-1鏈霉素+100 U·mL-1青霉素。

1.3 IGF-1和低溫應激分別處理卵丘細胞

卵丘細胞培養(yǎng)至第2代對數(shù)生長期時，加入含有0.05%的胰蛋白酶進行消化，在培養(yǎng)液中調(diào)整細胞數(shù)至4×105個/mL，傳代到6孔板，每孔含有2 mL細胞懸液，培養(yǎng)24h后根據(jù)試驗設計做以下處理（1）IGF-1及CAPE處理組：對其進行換液，分別加入0、50、100、200 ng·mL-1IGF-1、25 μg·mL-1CAPE和100 ng·mL-1IGF-1+25 μg·mL-1CAPE 到細胞培養(yǎng)液，每個處理組24個重復，培養(yǎng)30 h后，收集部分細胞用于RBM3 mRNA和蛋白的檢測；（2）依據(jù)（1）的結果，取0和100 ng·mL-1處理組各6個重復分別置于30℃和25℃條件下應激8 h，收集細胞，并以37℃為對照組，進行后續(xù)RBM3 mRNA和蛋白檢測實驗，并分析IGF-1作用對卵丘細胞低溫應激RBM3表達的影響；（3）檢測（1）中，0、100 ng·mL-1IGF-1和100 ng·mL-1IGF-1+25 μg·mL-1CAPE處理組卵丘細胞，25℃條件下應激8 h的后Bax和Bcl-2的表達水平。IGF-1處理卵丘細胞時間及低溫應激時間根據(jù)預實驗確定。

1.4 不同處理組卵丘細胞凋亡率的檢測

將細胞培養(yǎng)板中0、100 ng·mL-1IGF-1和100 ng·mL-1IGF-1+25 μg·mL-1CAPE處理組細胞，用無血清PBS清洗3遍后，37℃，用0.05%胰蛋白酶消化3—5 min，加入含血清培養(yǎng)液終止消化，溫柔吹打使細胞懸浮，移入1.5 mL 離心管中。經(jīng) 1 000 r/min 離心 10 min，用PBS重懸細胞，并使其濃度達到1×107個/mL。用 1.5 mL 細胞固定液 4℃固定卵丘細胞 30 min，離心清洗固定液，參照 Annexin VFITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明標記細胞。用流式細胞儀以每 10 000 個細胞為單位，分析細胞凋亡率。

1.5 RBM3、Bax、Bcl-2 mRNA表達檢測

1.5.1 細胞總RNA提取與cDNA合成 每個試驗組3個重復，將作用后卵丘細胞用PBS清洗3遍，參照貼壁細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，并參照反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，置于-20℃保存、備用。

1.5.2 Real-time PCR檢測RBM3、Bax、Bcl-2的表達 根據(jù)GenBank公布的牦牛的RBM3 mRNA序列設計RBM3檢測引物，Bax和Bcl-2 mRNA檢測引物參照筆者前期研究所用的引物序列[13, 17]，具體信息及反應條件見表1。反應體系主要包含1 μL cDNA模板，終濃度為0.25 μmol·mL-1的上下游引物各0.8 μL，2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，加ddH2O使終體積達到20 μL。反應條件：94℃預變性15 s，94℃預變性10 s，退火10 s（具體溫度見表1）、72℃延伸10 s，共35個循環(huán)，所有熒光定量PCR儀為Roche 480。內(nèi)參基因為，重復至少3次。采用相對定量分析法評估基因表達水平[18]。

表1 Real-time PCR引物信息

1.6 RBM3、Bax、Bcl-2蛋白表達Western blot檢測

不同處理組卵丘細胞經(jīng)預冷PBS清洗3次，置于冰盒中，用蛋白裂解液裂解細胞4 h，低溫下10 000×g 離心15 min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度并進行平衡，分裝置于-80℃?zhèn)溆?。檢測蛋白在離心管中與5×SDS上樣緩沖液混勻，沸水中變性10 min，以 20 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳后，電轉膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），室溫振蕩封閉2 h，分別加入檢測目標一抗，37℃搖床孵育2 h，DPBS振蕩清洗3次，每次5 min，加辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的二抗，37℃搖床孵育1 h，DPBS洗滌3次，電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒進行曝光約 2—5 min，待蛋白條帶顯色清晰時，立刻拍攝照片，記錄試驗結果，根據(jù)光密度分析蛋白表達水平。

1.7 RBM3蛋白定位檢測

用PBS清洗不同處理組卵丘細胞3次，加入含有0.1% TritonX-100的固定液常溫固定細胞1 h，免疫染色洗滌液清洗3遍后進行2 h室溫封閉，加入RBM3抗體（1﹕500）37℃搖床孵育2 h，清洗3遍，用FITC標記的二抗孵育1 h，清洗3遍后用5 ng·mL-1DAPI室溫作用3—5 min，清洗3遍后熒光顯微鏡觀察并成像。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，每組至少重復3次。＜0.05表示差異顯著，所有結果以“X±SE”表示。

2 結果

2.1 IGF-1及CAPE對牦牛卵丘細胞RBM3表達的調(diào)節(jié)

用不同濃度IGF-1作用培養(yǎng)至第三代的牦牛卵丘細胞，作用12 h檢測發(fā)現(xiàn)，IGF-1可顯著改變牦牛卵丘細胞RBM3的表達水平，其中IGF-1濃度為100 ng·mL-1處理組RBM3 mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于其他處理組（圖1）；50 和200 ng·mL-1IGF-1處理組中RBM3 mRNA和蛋白的表達水平動態(tài)不一致，其中RBM3 mRNA水平在50 ng·mL-1處理組高于其在200 ng·mL-1處理組的表達，但蛋白水平在50 ng·mL-1處理組低于200 ng·mL-1處理組，但兩組中RBM3 mRNA和蛋白的表達水平均顯著低于100 ng·mL-1IGF-1處理組，卻又顯著高于對照組（0 ng·mL-1IGF-1，圖1）。25 μg·mL-1CAPE處理組中RBM3 mRNA和蛋白水平均顯著低于對照組（圖1）。

2.2 低溫應激對不同處理組牦牛卵丘細胞RBM3表達的調(diào)節(jié)

將培養(yǎng)至第三代的牦牛卵丘細胞分別置于37、30和25℃的添加下繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，檢測RBM3的表達水平。如圖2所示，在30和25℃低溫應激下，牦牛卵丘細胞RBM3的表達水平顯著增高，其mRNA和蛋白的水平均顯著高于對照組（37℃），但在30和25℃兩組之間RBM3的蛋白和mRNA表達水平差異不顯著；

將100 ng·mL-1IGF-處理組的卵丘細胞不同溫度低溫應激培養(yǎng)8 h后，檢測RBM3的表達水平如圖3所示，其在30和25℃低溫應激處理兩組中的水平均顯著高于對照組（37℃），但低溫應激處理的兩組中RBM3的表達水平差異并不顯著；將6組卵丘細胞RBM3的表達水平進行對比，如圖4所示，以未經(jīng)IGF-1處理組37℃培養(yǎng)的細胞為對照組，發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 ng·mL-1IGF-處理組的卵丘細胞低溫應激后，細胞中RBM3 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于其中未經(jīng)IGF-處理而經(jīng)受低溫應激的卵丘細胞中的表達水平。

A：不同濃度IGF-1和CAPE對牦牛卵丘細胞RBM mRNA表達的影響；B：不同濃度IGF-1和CAPE處理組牦牛卵丘細胞RBM3蛋白檢測；C：不同濃度IGF-1和CAPE對牦牛卵丘細胞RBM 蛋白表達的影響；不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

A：不同溫度低溫應激處理對牦牛卵丘細胞RBM mRNA表達的影響；B：不同溫度低溫應激處理組牦牛卵丘細胞RBM3蛋白檢測；C：不同溫度低溫應激處理對牦牛卵丘細胞RBM 蛋白表達的影響；不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

檢測6個處理組卵丘細胞RBM3的表達水平如圖4所示，以未經(jīng)IGF-1處理組37℃培養(yǎng)的細胞為對照組，發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 ng·mL-1IGF-處理組的卵丘細胞低溫應激后，細胞中RBM3 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于其在未經(jīng)IGF-處理而經(jīng)受低溫應激卵丘細胞中的表達水平。

2.3 RBM3蛋白在不同處理組卵丘細胞分布的檢測

對IGF-1不同處理組卵丘細胞用RBM3蛋白進行免疫標記，如圖5所示，熒光檢測顯示未經(jīng)IGF-1處理組，RBM3主要在牦牛卵丘細胞的細胞質表達（圖5-A），50 ng·mL-1IGF-1處理組RBM 3蛋白也主要表達于細胞質（圖5-B），但其熒光強度高于對照組（0 IGF-1）。100和200 ng·mL-1IGF-1處理組中，卵丘細胞的胞質核細胞核均可強表達RBM蛋白（圖5-C，D）。

對照組和100 ng·mL-1IGF-1處理組卵丘細胞經(jīng)25℃低溫應激8 h后檢測后，用免疫熒光技術檢測RBM3蛋白，結果如圖6所示，低溫應激后對照組卵丘細胞胞質和胞核均可檢測到RBM3蛋白（圖6-A），熒光強度高于未經(jīng)低溫應激處理的對照組（圖6-B）。100 ng·mL-1IGF-1處理組卵丘細胞25℃低溫應激前后胞質和胞核均可檢測到RBM3蛋白（圖6-C），低溫應激前經(jīng)受100 ng·mL-1IGF-1處理組的卵丘細胞中RBM3蛋白熒光強度高于未經(jīng)IGF-1處理的低溫應激卵丘細胞。

2.4 不同處理組后卵丘細胞凋亡率的檢測

利用流行細胞儀對不同處理組的細胞進行凋亡檢測，如圖 7、表 2所示，30和25℃低溫應激卵丘細胞8 h均可增加其凋亡率，分別為（16.23±2.81）%和（25.86±1.09）%，100 ng·mL-1IGF-1處理后的卵丘細胞，其在25℃低溫應激8 h凋亡率呈顯著降低趨勢，凋亡率為（15.94±2.03）%，100 ng·mL-1IGF-1+ CAPE處理組中卵丘細胞25℃低溫應激8 h的凋亡率為（20.14±2.65）%，均顯著高于對照組中的細胞凋亡率（7.36±0.65）%。

A：不同溫度低溫應激處理對100 ng·mL-1 IGF-1處理組牦牛卵丘細胞RBM mRNA表達的影響；B：不同溫度低溫應激處理組牦牛卵丘細胞RBM3蛋白檢測；C：不同溫度低溫應激處理對100 ng·mL-1 IGF-1處理組牦牛卵丘細胞RBM 蛋白表達的影響

A：不同處理組卵丘細胞低溫應激后RBM mRNA表達比較；B：不同處理組卵丘細胞低溫應激后RBM蛋白表達的檢測；C：不同處理組卵丘細胞低溫應激后RBM蛋白表達比較

綠色熒光為RBM3蛋白；藍色熒光為標記細胞核的DAPI

綠色熒光為RBM3蛋白；藍色熒光為標記細胞核的DAPI

2.5 不同處理組卵丘細胞低溫應激后Bax和Bcl-2表達的變化

比較對照組、100 ng·mL-1IGF-1和100 ng·mL-1IGF-1+CAPE處理組卵丘細胞經(jīng)25℃低溫應激8 h后細胞凋亡相關基因Bax和Bcl-2的表達水平顯示，100 ng·mL-1IGF-1處理組卵丘細胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平最高，100 ng·mL-1IGF-1+CAPE處理組顯表達水平次之，對照組（0 IGF-1）表達水平最低（圖8-A、9-A和B）；而Bax mRNA和蛋白的表達水平在100 ng·mL-1IGF-1處理組中最低，對照組中最高，100 ng·mL-1IGF-1+CAPE處理組中Bax mRNA和蛋白的表達處于中間水平（圖8-B、9-A和8-C）；經(jīng)100 ng·mL-1IGF-1處理后，低溫應激卵丘細胞中Bcl-2/Bax的比值顯著高于其在對照組和100 ng·mL-1IGF-1+CAPE處理組中的比值，且IGF-1+ CAPE處理組中的比值高于對照組。

A: 37℃卵丘細胞; B: 30℃應激8h卵丘細胞; C: 25℃應激8h卵丘細胞; D: 100 ng·mL-1 IGF-1處理組牦牛卵丘細胞25℃應激8h; E: 100 ng·mL-1 IGF-1+CAPE處理組牦牛卵丘細胞25℃應激8h

A：Bcl-2 mRNA的表達水平；B：Bax mRNA的表達水平；C：Bcl-2和Bax mRNA表達水平的比率

A：Bcl-2和Bax蛋白表達Western blot檢測；B：Bcl-2 蛋白的表達水平；C：Bax 蛋白的表達水平；D：Bcl-2和Bax蛋白表達水平的比率

表2 不同處理組牦牛卵丘細胞凋亡率

同一列中不同字母表示組間差異極顯著（＜0.01）

The different letters in the same column mean significant difference between the groups (＜0.01)

3 討論

RBM3和CIRP結合在一起，作為應激調(diào)節(jié)基因，在正常生理溫度下保護體內(nèi)細胞免受內(nèi)在刺激造成的損傷外[19]，機體遭受低溫應激刺激也可誘導其表達[20]。相關學者研究發(fā)現(xiàn)，由于哺乳動物睪丸組織位于體表，溫度往往低于體內(nèi)核心器官，該器官組織可高水平表達RBM3和CIRP蛋白，其中RBM的表達主要位于睪丸支持細胞，有助于動物精子生成[21]。CIRP和RBM3在體外的生理學功能較為相似，主要為參與細胞或其他器官組織冷凍，尤其是卵母細胞和胚胎的冷凍[22]。因此研究細胞低溫應激過程中CIRP和RBM3表達的變化，對細胞冷凍技術的改良尤為重要。卵丘細胞與卵母細胞緊密結合在一起，兩者之間可進行信息傳導和物質交互，在體外和體內(nèi)均可促進卵母細胞的成熟。本研究以卵丘細胞為模型，探索其遭受低溫應激過程中RBM3表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)在30℃和25℃中低溫溫度應激時，RBM3水平增加，雖在25℃中呈現(xiàn)下降趨勢，但差異并不顯著，此結果更進一步證實25—34℃溫度范圍是誘導RBM3表達的最佳低溫誘導溫度[23-24]。卵丘細胞經(jīng)受低溫誘導高水平表達RBM3也為卵母細胞冷凍技術的優(yōu)化提供了新的突破點。

IGF-1作用動物卵母細胞成熟關鍵因子，可調(diào)控細胞凋亡、增殖與分化等多種信號通路[25]。本研究在卵母細胞體外培養(yǎng)過程中加入不同濃度IGF-1，檢測RBM3的水平發(fā)現(xiàn)，100 ng·mL-1IGF-1可顯著提高卵丘細胞RBM3的表達，此作用濃度與課題組前提研究結果一致[14]，進一步確定IGF-1對牦牛生殖相關細胞體外培養(yǎng)的最佳作用濃度，也與100 ng·mL-1IGF-1可顯著提高卵母細胞CIRP表達的結果相似[15]。為了進一步探索IGF-1對RBM3的提高與溫度應激是否存在關聯(lián)，本研究比較了0和100 ng·mL-1IGF-1作用的卵丘細胞經(jīng)受應激后RBM3的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)IGF-1更進一步提高了卵丘細胞低溫應激時RBM3的表達水平，但在IGF-1作用時抑制RBM3的表達，卵丘細胞凋亡水平增高，揭示IGF-1可通過上調(diào)牦牛卵丘RBM3的表達提升其對低溫應激的適應性，但其在其他細胞中是否具有相似的生物學作用仍需證實。研究同時發(fā)現(xiàn)，在IGF-1+CAPE處理組中，卵丘細胞的凋亡水平顯著低于對照組，表明除上調(diào)RBM3外，IGF-1也可以通過其他信號通路降低低溫應激誘導的細胞凋亡。

免疫熒光檢測顯示，正常條件下RBM3蛋白的表達主要位于牦牛卵丘細胞的細胞質，低濃度IGF-1并不影響RBM3蛋白表達部位的改變。高濃度IGF-1和低溫應激條件下卵丘細胞的胞質和胞核均可表達IGF-1，表明RBM3蛋白表達部位發(fā)生改變，且IGF-1最佳濃度作用組熒光強度更強，這種變化可能與IGF-1聯(lián)合RBM3發(fā)揮其他生理學功能有關，如兩者均可調(diào)控細胞生長、分化、胞內(nèi)其他mRNA的轉錄和翻譯等[5-6, 26]。人的骨髓瘤細胞中，IGF-1可聯(lián)合AKT激酶細胞通路抑制細胞凋亡[27]，本研究中高濃度IGF-1作用后，RBM3蛋白表達部位發(fā)生改變可能是由于IGF-1激活AKT激酶，從而改變RBM3磷酸化修飾，影響蛋白質的定位，但其具體機制仍需研究證實。除此之外，也可能與RBM3啟動卵丘細胞適應低溫應激分子信號有關。

RBM3和CIRP可通過多種信號通路抑制細胞凋亡的發(fā)生，如誘導Bcl-2的表達，抑制caspase的活性[28]。低溫應激過程中RBM3和CIRP的高水平表達可增加細胞的生長能力，減少低溫誘導對其的損害，該生物學功能與細胞凋亡水平減低存在一定關聯(lián)[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，在IGF-1處理組卵丘細胞經(jīng)低溫誘導RBM3表達增加，細胞凋亡率也顯著降低，且細胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達水平顯著高于對照組，Bax水平降低，該結果與IGF-1正常溫度條件下可調(diào)控牦牛卵丘細胞Bax和Bcl-2表達降低細胞凋亡的結論相似[14]。表明IGF-1降低低溫誘導卵丘細胞凋亡的水平與其調(diào)控RBM3的表達相關，也為探索IGF-1調(diào)控低溫誘導相關因子RBM3和CIRP提高冷凍-解凍后細胞的發(fā)育能力提供了重要理論依據(jù)。

4 結論

牦牛卵丘細胞體外培養(yǎng)過程中100 ng·mL-1胰島素樣生長因子1和中低溫誘導均可誘導RNA結合基序蛋白3的表達，且胰島素樣生長因子1可通過調(diào)控RNA結合基序蛋白3抑制低溫誘導卵丘細胞中B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x和B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因的表達，降低細胞凋亡水平。研究結果為揭示胰島素樣生長因子1和RNA結合基序蛋白3參與動物機體或細胞免受低溫損傷的分子機制提供了關鍵信息。有助于通過相關生長因子的改善哺乳動物細胞和胚胎冷凍技術、提高冷凍-解凍后細胞的發(fā)育能力。

[1] JACKSON T C, MANOLE M D, KOTERMANSKI S E, JSCKSON E K, CLARK R S, KOCHANEK P M. Cold stress protein RBM3 responds to temperature change in an ultra-sensitive manner in young neurons., 2015, 305(12): 268-278.

[2] KIM D Y, KIM K M, KIM E J, JANG W G. Hypothermia-induced RNA-binding motif protein 3 (RBM3) stimulates osteoblast differentiation via the ERK signaling pathway., 2018, 498(3): 459-465.

[3] WONG J J, AU A Y, GAO D, PINELLO N, KWOK C T, THOENG A, LAU K A, GORDON J E, SCHMITZ U, FENG Y, NGUYEN T V, MIDDLETON R, BAILEY C G, HOLST J, RASKO J E, RITCHIE W. RBM3 regulates temperature sensitive miR-142-5p and miR-143 (thermomiRs), which target immune genes and control fever., 2016, 44(6): 2888-2897.

[4] VENUGOPAL A, SUBRAMANIAN D, BALMACEDA J, ROY B, DIXON D A, UMAR S, WEIR S J, ANANT S. RNA binding protein RBM3 increases beta-catenin signaling to increase stem cell characteristics in colorectal cancer cells., 2016, 55(11): 1503-1516.

[5] SHI H Z, YAO R Z, LIAN S, LIU P, LIU Y, YANG Y Y, YANG H M, LI S H. Regulating glycolysis, the TLR4 signal pathway and expression of RBM3 in mouse liver in response to acute cold exposure., 2019, 22(3):366-376.

[6] DANNO S, NISHIYAMA H, HIGASHITSUJI H, YOKOI H, XUE J H, ITOH K, MATSUDA T, FUJITA J. Increased transcript level of RBM3, a member of the glycine-rich RNA-binding protein family, in human cells in response to cold stress., 1997, 236(3): 804-807.

[7] YANG H J, JU F, GUO X X, MA S P, WANG L, CHENG B F, ZHUANG R J, ZHANG B B, SHI X, FENG Z W, WANG M. RNA-binding protein RBM3 prevents NO-induced apoptosis in human neuroblastoma cells by modulating p38 signaling and miR-143., 2017, 7(1): 41738.

[8] 李云龍, 李儉, 李昌盛, 李靜輝, 孟宇, 楊煥民, 李士澤. 冷應激條件下豬睪丸細胞中RNA結合基序蛋白3過表達對Caspase3表達的影響. 中國應用生理學雜志, 2016, 32(2): 102-105.

LI Y L, LI J, LI C S, LI J F, MENG Y, YANG H M, LI S Z. Effects of RNA binding motif protein 3 overexpression on caspase 3 expression in swine testicular cell under cold exposure., 2016, 32(2): 102-105. (in Chinese)

[9] USHIO A, ETO K. RBM3 expression is upregulated by NF-kappaB p65 activity, protecting cells from apoptosis, during mild hypothermia., 2018, 119(7):5734-5749.

[10] ADASHI E Y, RESNICK C E, D'ERCOLE A J, SVOBODA M E, VAN J J. Insulin-like growth factors as intraovarian regulators of granulosa cell growth and function., 1985, 6(3): 400-420.

[11] BYRNE A T, SOUTHGATE J, BRISON D R, LEESE H J. Regulation of apoptosis in the bovine blastocyst by insulin and the insulin-like growth factor (IGF) superfamily., 2002, 62(4): 489-495.

[12] PERUZZI F, PRISCO M, DEWS M, SALOMONI P, GRASSILLI E, ROMANO G, CALABRETTA B, BASERGA R. Multiple signaling pathways of the insulin-like growth factor 1 receptor in protection from apoptosis., 1999, 19(10): 7203-7215.

[13] LEIBOWITZ B, YU J. Mitochondrial signaling in cell death via the Bcl-2 family., 2010, 9(6): 417-422.

[14] 潘陽陽, 崔燕, 樊江峰, 李谷月, 余四九. 胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對牦牛卵丘細胞熱休克蛋白70(HSP70)表達的影響及其與細胞凋亡的關聯(lián)性分析. 農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2015, 23(9): 1208-1216.

PAN Y Y, CUI Y, FAN J F, LI G Y, YU S J. The effect of IGF-1 on HSP70 expression of yak cumulus cells and its relation with apoptosis.2015, 23(9): 1208-1216. (in Chinese)

[15] PAN Y, CUI Y, HE H, BALOCH A R, FAN J, XU G, HE J, YANG K, LI G, YU S. Developmental competence of mature yak vitrified- warmed oocytes is enhanced by IGF-I via modulation of CIRP during in vitro maturation., 2015, 71(3): 493-498.

[16] YANG K, ZHANG Q, WEN Z, PAN Y, YU S, HE J, YANG X, LIU P, CUI Y. Cloning and expression of cold-inducible RNA binding protein in domestic yak ()., 2016, 75(4): 460-466.

[17] 潘陽陽, 王萌, 余四九, 崔燕, 何俊峰. EGF對牦牛凍精運動性能、細胞凋亡和IVF胚胎發(fā)育潛力的影響. 畜牧獸醫(yī)學報, 2017, 48(5): 854-862.

PAN Y Y, WANG M, YU S J, CUI Y, HE J F. The effects of EGF on yak frozen sperm motility, apoptosis and the development competence of embryos after IVF.2017, 48(5): 854-862. (in Chinese)

[18] PFAFFL M W, HORGAN G W, DEMPFLE L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR., 2002, 30(9): e36.

[19] LLEONART M E. A new generation of proto-oncogenes: cold- inducible RNA binding proteins., 2010, 1805(1): 43-52.

[20] WANG X, CHE H, ZHANG W, WANG J, KE T, CAO R, MENG S, LI D, WEI O, CHEN J, LUO W. Effects of mild chronic intermittent cold exposure on rat organs.,2015, 11(10): 1171-1180.

[21] DANNO S, ITOH K, MATSUDA T, FUJITA J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis., 2000, 156(5): 1685-1692.

[22] JO J W, JEE B C, SUH C S, KIM S H. The beneficial effects of antifreeze proteins in the vitrification of immature mouse oocytes., 2012, 7(5): e37043.

[23] NISHIYAMA H, ITOH K, KANEKO Y, KISHISHITA M, YOSHIDA O, FUJITA J. A glycine-rich RNA-binding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth., 1997, 137(4): 899-908.

[24] ZHU X, BUHRER C, WELLMANN S. Cold-inducible proteins CIRP and RBM3, a unique couple with activities far beyond the cold., 2016, 73(20): 3839-3859.

[25] KENCHAPPA P, YADAV A, SINGH G, NANDANA S, BANERJEE K. Rescue of TNFalpha-inhibited neuronal cells by IGF-1 involves Akt and c-Jun N-terminal kinases., 2004, 76(4): 466-474.

[26] MITSIADES C S, MITSIADES N, POULAKI V, SCHLOSSMAN R, AKIYAMA M, CHAUHAN D, HIDESHIMA T, TREON S P, MUNSH N C, RICHARDSON P G, Activation of NF-kappaB and upregulation of intracellular anti-apoptotic proteins via the IGF-1/Akt signaling in human multiple myeloma cells: therapeutic implications., 2002, 21(37):5673-5683.

[27] MARTINEZ L, AGUILERA A, PEREZ P, PIGNATELLI J, FERNANDEZ A M, TORRES I. Cell-specific expression of insulin/insulin-like growth factor-I receptor hybrids in the mouse brain., 2019, 45:25-30.

[28] FERRY A L, VANDERKLISH P W, DUPONT E E. Enhanced survival of skeletal muscle myoblasts in response to overexpression of cold shock protein RBM3., 2011, 301(2): 392-402.

[29] VAND W, CONFIDES A L, JUDGE A R, VANDERKLISH P W, DUPONT E E. Cold shock protein RBM3 attenuates atrophy and induces hypertrophy in skeletal muscle., 2018, 39(1/2): 35-40.

[30] FUJITA T, HIGASHITSUJI H, LIU Y, ITOH K, SAKURAI T, KOJIMA T, KANDORI S, NISHIYAMA H, FUKUMOTO M, SHIBASAKI K, FUJITA J. TRPV4-dependent induction of a novel mammalian cold-inducible protein SRSF5 as well as CIRP and RBM3., 2017, 7(1): 2295.

RNA-binding Motif Protein 3(RBM3) Expression is Regulated by Insulin-like Growth Factor (IGF-1) for Protecting Yak () Cumulus Cells from Apoptosis during Hypothermia Stress

PAN YangYang1, WANG Meng1, RUI Xian2, WANG LiBin1,HE HongHong1, WANG JingLei1, MA Rui1, XU GengQuan1, CUI Yan1, FAN JiangFeng1, YU SiJiu1

（1College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2Lanzhou Biological Pharmaceutical Factory, China animal Husbandry Industry Co., LTD, Lanzhou 730046）

【】The aim of this study was to verify the relationship between insulin-like growth factor 1 (insulin-like growth factor, IGF-1) and RNA binding motif protein 3 (RBM3) during hypothermia stress and cell freezing in animals, and to investigate the mechanism of IGF-1 involved in inhibiting hypothermia injury of mammalian cells.【】Yak () cumulus cells were cultured, the effects of different concentrations (0, 50, 100 and 200 ng·mL-1) IGF-1 and hypothermia stress (25℃ and 30℃) on RBM3 expression in yak cumulus cells were detected by the methods of real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR), Western blot (WB) and immunofluorescence. The expression of RBM3 was compared when the cumulus cells treated with 100 ng·mL-1and 0 IGF-1 for 30 h and then stressed at low temperature (25℃ and 30℃) for 8 h. The difference of apoptosis level of cumulus cells was evaluated from the groups that treated with 0 ng·mL-1IGF-1, 100 ng·mL-1IGF-1, 100 ng·mL-1IGF-1+RBM3 inhibitor for 30 h and then stressed at 25℃ for 8 h. The expression of apoptosis-related genes (Bax and Bcl-2) in cumulus cells from three groups was also detected at mRNA and protein levels.【】(1) The expression level of RBM3 in cumulus cells treated with IGF-1 was significantly higher than that in control group (0 ng·mL-1), which was the highest in cumulus cells from 100 ng·mL-1IGF-1 group. The RBM3 protein could be detected in nucleus and cytoplasm of cumulus cells, which only expressed in cytoplasm under 0 and 50 ng·mL-1treatment groups. (2) The levels of RBM3 could be increased by hypothermia stress, and which also could be enhanced when 100 ng·mL-1IGF-1 was added before cold stress. The RBM3 protein could be detected in nucleus and cytoplasm of cumulus cells after hypothermia stress and treated with IGF-1. (3) After stress at 25℃ for 8 h, the apoptosis rate of cumulus cells treated with 100 ng·mL-1IGF-1 was (15.94 ±2.03)%, which was significantly lower than those of cumulus cells without IGF-1 treatment (25.86 ±1.09)% or with 100 ng·mL-1IGF-1+RBM3 inhibitor (20.14±2.65)%. The expression level of Bcl-2 was significantly higher than those in the control and IGF-1+RBM3 inhibitor groups (＜0.05), while the expression level of Bax was significantly lower than control and IGF-1+RBM3 inhibitor groups (＜0.05). 【】RBM3 was involved in the regulation ofhypothermia stress in yak cumulus cells, and IGF-1 could regulate its expression level in hypothermia stress, which helped to reducing the apoptosis of cumulus cells induced by low temperature. The results in this study provided the key information for revealing the molecular mechanism of IGF-1 and RBM3 involved in the protection of animal bodies or cells fromhypothermia damage, and provided theoretical basis for the improvement of somatic and germ cell freezing techniques.

yak; RNA-binding motif protein 3(RBM3); insulin-like growth factor (IGF-1); hypothermia stress; apoptosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.014

2019-05-05；

2019-10-28

國家自然科學基金（31702311）、甘肅省高等學校創(chuàng)新能力提升項目（2019B-081）、甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院創(chuàng)新基金（JYCX-KX016）、甘肅農(nóng)業(yè)大學伏羲青年英才基金（Gaufx-02Y10）、甘肅農(nóng)業(yè)大學博士科研啟動基金（GSAU-RCZX201701）

潘陽陽，E-mail：panyangyang_2007@126.com。通信作者余四九，E-mail：sjyu@163.com

（責任編輯 林鑒非）