基于PTN系統(tǒng)分析不同種植地轉(zhuǎn)基因水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌菌群的多樣性

趙艷，王天圻，朱軍莉

基于PTN系統(tǒng)分析不同種植地轉(zhuǎn)基因水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌菌群的多樣性

趙艷，王天圻，朱軍莉

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018）

【】比較不同種植地、不同品種來源的轉(zhuǎn)基因（genetically modified，GM）水稻近等基因系種子內(nèi)生真菌的豐富度和多樣性，探討變異發(fā)生的影響因素，為研究GM水稻種子內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的非預(yù)期變異提供科學(xué)基礎(chǔ)。收集轉(zhuǎn)抗草甘膦水稻株系（transgenic line，T），及相應(yīng)的對照樣本親本品種（parent variety，P）和非轉(zhuǎn)基因組培再生株系（non-transgenic regeneration line from tissue culture，NR），建立親本對照-轉(zhuǎn)基因株系-非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨╬arent control-transgenic plant line-non-transgenic control，PTN）近等基因系。粳稻品種日本晴親本（P1）及其相應(yīng)的T16和NR25組成P1近等基因系（P1 near-isogenic line，P1L），粳稻品種PJ574親本（P2）及其相應(yīng)的T23和NR18組成P2近等基因系（P2 near-isogenic line，P2L）。在海南?。℉ainan province，H）和浙江省富陽市（Fuyang，Zhejiang province，F(xiàn)）兩地種植并收獲水稻種子，采用組織培養(yǎng)法分離內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對菌株分類鑒定。以分離率（isolation rate，IR）、分離頻率（isolation frequency，IF）、豐富度指數(shù)Margalef（）、多樣性指數(shù)Shannon-Wiener（）和均勻度指數(shù)Evenness（）反映真菌的結(jié)構(gòu)和分布，以Sorenson相似性系數(shù)（）和Fisher精確檢驗（Fishers exact test）結(jié)果描述水稻樣本之間的內(nèi)生真菌菌群組成差異。從海南省和浙江省富陽市兩地的P1L和P2L近等基因系水稻種子樣本中共分離121株內(nèi)生真菌，鑒定為15個屬，其中，、、、為優(yōu)勢菌屬，為兩地共有的優(yōu)勢菌屬。F地水稻種子內(nèi)生真菌總IR（4.61%）是H地樣本（0.83%）的5.05倍。F地樣本內(nèi)生真菌類群的豐富度指數(shù)（2.29），Shannon-Wiener（）多樣性指數(shù)（1.63）和均勻度指數(shù)（0.66）均顯著高于H地樣本。H地種植的P1L和P2L種子內(nèi)生真菌菌屬組成的相似性系數(shù)（）為0.615，F(xiàn)地種植時二者的=0.737，均為中等相似，F(xiàn)isher精確檢驗分析表明二者無顯著性差異（＞0.05）。除HT16外的GM株系與相應(yīng)親本種子內(nèi)生真菌類群的相似性系數(shù)為0.500—0.667，均為中等相似。但與相應(yīng)親本相比，GM水稻株系種子內(nèi)生真菌的IF和菌屬數(shù)存在顯著性非預(yù)期變異，其中IF變異方向和幅度因種植地不同而波動。而且FT16增加2個菌屬和，HT23增加了1個菌屬，F(xiàn)T23增加了和2個菌屬，這些GM株系種子內(nèi)生真菌菌屬增多的變異來源于轉(zhuǎn)基因插入突變，需要關(guān)注其安全性。而GM株系種子內(nèi)生真菌種類減少的變異來源于組織培養(yǎng)無性系變異，較為安全。水稻種子真菌IF變異幅度及排序：P1和P2品種兩地之間差異（30.58%）＞P1和P2品種之間差異（27.28%）＞NR株系變異（23.14%）＞GM株系變異（22.32%）。種子內(nèi)生真菌總屬數(shù)變異幅度及排序：P1和P2品種兩種植地之間差異（9）＞P1和P2品種之間差異（8）=NR株系變異（8）=GM株系變異（8）。水稻種子內(nèi)生真菌豐富多樣，可培養(yǎng)內(nèi)生真菌絕大多數(shù)為子囊菌。不同種植地域水稻種子內(nèi)生真菌菌群組成存在差異，鐮刀菌（）為海南省和浙江省富陽市兩地水稻種子的共有優(yōu)勢內(nèi)生菌屬。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)均顯著影響水稻種子內(nèi)生真菌類群的結(jié)構(gòu)，但其非預(yù)期變異效應(yīng)低于種植地域影響和品種差異，其中GM水稻種子內(nèi)生真菌菌屬種類增多的變異主要來源于轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)，需安全性評估。

轉(zhuǎn)基因水稻種子；可培養(yǎng)內(nèi)生真菌；非預(yù)期變異；PTN系統(tǒng)；多樣性

0 引言

【研究意義】水稻是最重要的主糧作物之一，世界上一半以上的人口以稻米為食?；蚬こ桃驯挥糜诟纳瓢ㄋ尽⒂衩缀托←溤趦?nèi)的多種作物的農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)價值。評估轉(zhuǎn)基因植物的安全性對于其商業(yè)化至關(guān)重要，實質(zhì)等同性是基本原則[1]，公眾對轉(zhuǎn)基因（genetically modified，GM）作物非預(yù)期效應(yīng)影響人類健康和生態(tài)環(huán)境的擔(dān)憂是當(dāng)前GM作物商品化應(yīng)用的障礙[2]。研究GM水稻近等基因系的種子內(nèi)生真菌多樣性為進(jìn)一步評估有關(guān)非預(yù)期效應(yīng)奠定科學(xué)基礎(chǔ)，對農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的健康發(fā)展意義重大。【前人研究進(jìn)展】GM作物的非預(yù)期效應(yīng)一直是國內(nèi)外研究熱點。Jiao等[3]研究表明GM水稻種子某些營養(yǎng)成分的含量存在非預(yù)期變異。趙艷等[2]利用PTN樣本系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)GM水稻種子蛋白質(zhì)非預(yù)期變異主要來源于組織培養(yǎng)變異，基因插入的影響較小。Park等[1]研究證實水稻種子的營養(yǎng)品質(zhì)不受基因插入的影響，并且表明環(huán)境因素對稻谷營養(yǎng)成分的影響比遺傳背景的影響更大。GM植物一些代謝物的非預(yù)期變異可能影響植物體內(nèi)環(huán)境進(jìn)而影響植物內(nèi)生微生物的定植。寄居在植物組織和器官內(nèi)部，并且不會對宿主造成損害的真菌和細(xì)菌等微生物被稱為內(nèi)生菌或內(nèi)生微生物[4]。前人研究表明轉(zhuǎn)植物可直接或間接地影響農(nóng)作物周圍環(huán)境微生物[5]。Pan等[6]報道內(nèi)生真菌的多樣性與玉米植物的基因型有關(guān)。劉月廉等[7]發(fā)現(xiàn)與親本相比，GM水稻根部內(nèi)生真菌分離率、種類多樣性以及真菌侵染率和侵染指數(shù)無顯著差異，轉(zhuǎn)基因?qū)λ靖績?nèi)生真菌分布影響不顯著。【本研究切入點】將種植地域環(huán)境和轉(zhuǎn)基因因素結(jié)合探討GM水稻種子內(nèi)生菌類群的研究仍鮮見報道。植物內(nèi)生菌可在植物系統(tǒng)間進(jìn)行內(nèi)部傳播，水稻種子既是內(nèi)生菌的攜帶者和傳播者，又是主食稻米的直接原料，內(nèi)生真菌菌群變異可能涉及病害菌和產(chǎn)毒菌，從而影響水稻的種植生產(chǎn)和食用安全?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以粳稻品種日本晴（P1）和PJ574（P2）為材料，收集親本品種（parent variety，P）、轉(zhuǎn)基因株系（transgenic line，T）、及非轉(zhuǎn)基因組培再生株系（non-transgenic regeneration line from tissue culture，NR）等樣本，分別建立水稻PTN近等基因系。分析不同種植地、不同品種來源的PTN近等基因系種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)特征和生物多樣性，比較樣本間內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的差異，探究種植地域環(huán)境、品種遺傳背景對水稻種子內(nèi)生真菌多樣性的影響貢獻(xiàn)大小，為從種子內(nèi)生菌分布角度客觀評估GM水稻的非預(yù)期效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻轉(zhuǎn)基因株系（T）以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛颖荆≒、NR）的來源：水稻親本（P）→愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)和感受態(tài)細(xì)胞制備→外源基因轉(zhuǎn)化愈傷組織→草甘膦抗性愈傷組織的篩選→再生植株→轉(zhuǎn)基因株系（T）和非轉(zhuǎn)基因組培再生株系（NR）。具體包括粳稻日本晴品種（P1）及其相應(yīng)的GM株系T16和組培對照株系NR25組成的P1近等基因系（P1 near-isogenic line，P1L）；粳稻品種PJ574（P2）及其相應(yīng)的GM株系T23和組培對照株系NR18組成的P2近等基因系（P2 near-isogenic line，P2L）。

供試水稻樣本于2017年12月種植于海南省（Hainan province，H），2018年5月收獲。2018年6月種植于浙江省富陽市（Fuyang，Zhejiang province，F(xiàn)），11月收獲。收獲種子自然晾干后，4℃保存，種子收獲后2個月內(nèi)完成微生物分離試驗，盡量減少儲存時間的影響。

1.2 水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的分離純化

水稻種子表面消毒：水稻種子脫殼后，參照CUI等[8]方法對水稻種子表面消毒，用無菌水沖洗種子5次，洗去表面灰塵雜質(zhì)，再依次使用70%乙醇浸泡3 min、5%次氯酸鈉浸泡5 min、70%乙醇清洗30 s、最后無菌水沖洗6次。取最后一次清洗液100 μL涂布在PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d，作為檢驗種子表面徹底消毒的對照。

內(nèi)生真菌的分離：采用組織塊分離法[8]，將表面消毒的種子放到墊有濾紙的無菌平板上，超凈臺上稍晾干，切成兩段，切面朝下半埋接種于PDA培養(yǎng)基。在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6—10 d，待組織塊周圍長出菌絲體后，挑取菌絲接到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。

1.3 水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的鑒定

無菌條件下，將純化后的真菌續(xù)接到PDA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。刮取足量的菌絲體到滅菌潔凈研缽中，用液氮充分研磨。采用CTAB法提取菌體DNA[9]，以DNA為模板，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL 10×PCR buffer（含Mg2+）、1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL DNA模板、4 μL dNTP、1 μL Taq酶（最后加），dH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增程序為94℃ 5 min；94℃ 45 s，54℃ 30 s，72℃ 90 s，32個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。用Blast軟件將測序結(jié)果與GenBank中已知菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行同源性比對鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

對稻米內(nèi)生真菌的分離率（isolation rate，IR）、分離頻率（isolation frequency，IF）進(jìn)行統(tǒng)計，用Margalef指數(shù)（）分析真菌類群的豐富度，Shannon-Weiner多樣性指數(shù)（）、Evenness均勻度指數(shù)（）及Sorenson相似性系數(shù)（）分析內(nèi)生真菌的多樣性及分布特征[10]。

分離率IR（%）=（稻米樣本長菌組織塊數(shù)/稻米全部樣本組織塊數(shù)）×100。分離率是衡量植物組織中內(nèi)生真菌的定植豐度和每個組織塊受侵染的發(fā)生頻率。

分離頻率IF（%）=（）×100。其中：為某種稻米內(nèi)生真菌的菌株數(shù)；為全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)。

IF＞10%的內(nèi)生真菌為優(yōu)勢菌，1%＜IF≤10%的內(nèi)生真菌為常見菌，IF≤1%為稀有菌[11]。當(dāng)N取值為所有樣本內(nèi)生真菌合集時，某種真菌相應(yīng)占比用IF表示；當(dāng)N取值為部分特定樣本組合時某種真菌相應(yīng)占比稱為相對分離頻率（relative frequency，RF），便于樣本間的直觀比較。

Margalef指數(shù)=（-1）/ln。其中：為類群總數(shù)；為內(nèi)生真菌總數(shù)目。

均勻度指數(shù)=/ln。其中：為Shannon-Wiener指數(shù)，為群落中內(nèi)生真菌的類群總數(shù)。

Sorenson相似性指數(shù)=2/（+）。式中：為兩種植地（或品系或不同基因型）共有的種數(shù)或?qū)贁?shù)；為一個種植地（或品系或不同基因型）內(nèi)生真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)；為另一種植地（或品系或不同基因型）內(nèi)生真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)。當(dāng)為0.00—0.25時，極不相似；當(dāng)為0.25—0.50時，中等不相似；當(dāng)為0.50—0.75時，中等相似；當(dāng)為0.75—1.00時，極相似。

利用軟件spss17.0進(jìn)行Fisher精確檢驗（Fishers exact test）分析比較樣本間真菌菌群組成的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 H和F種植地水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的組成

接種后在28℃培養(yǎng)7 d，洗滌液對照無菌落長出（圖1-a），說明試驗稻米材料表面已徹底消毒。待組織塊在PDA中長出較明顯菌落時（圖1-b—圖1-e）續(xù)接純化培養(yǎng)并進(jìn)行菌落形態(tài)觀測。從不同種植地（H、F）PTN系統(tǒng)樣本組成的2個近等基因系2 400個稻米組織塊中共分離內(nèi)生真菌121株，總分離率（IR）為5.04%（表1），根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)合并為43種真菌（圖2）。以提取的真菌DNA為模版，ITS1和ITS4為引物的PCR擴(kuò)增條帶約在550 bp，測序后進(jìn)行BLAST分析，將相似度＞97%的鑒定為同屬，＞99%的鑒定為同種[12]，因此，將43個菌株歸為3綱、4目、7科、15屬（表1）。

a：對照；b、c、d、e：菌落分離圖 a: control; b, c, d, e: colony separation diagram

上：培養(yǎng)皿正面；下：培養(yǎng)皿反面

2.2 不同種植地水稻種子內(nèi)生真菌的多樣性比較

2.2.1 海南省和浙江省富陽市兩地水稻樣本間的綜合比較 海南省種植（H）的水稻樣本共分離內(nèi)生真菌20株，歸為9個屬，其中8個屬為子囊菌綱，1個屬為半知菌綱。浙江省富陽市（F）種植地分離內(nèi)生真菌101株，歸為12個屬，全部屬于子囊菌綱。可見水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌大多為子囊菌綱。

表1 水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

H地水稻種子內(nèi)生真菌的總IR（0.83%）顯著低于F地樣本（4.61%）。以兩種植地所有水稻樣本內(nèi)生真菌菌株總數(shù)作為值，計算不同樣本中各內(nèi)生真菌屬的IF（表2），分析可知H和F兩地內(nèi)生真菌菌群的組成既有共性，又存在一定的差異。兩地的共有真菌包括、、、、和6個屬，共46株，分別占H和F地總菌株數(shù)的75.00%和30.70%，占兩地總菌株38.02%。H地特有、和3個菌屬共5株，占兩地總菌數(shù)4.13%。F地特有真菌包括6個屬共70株，分別為、、、、和，占比高達(dá)F地總菌株的69.3%和兩地總菌數(shù)的57.85%。表明水稻種子內(nèi)生真菌種群具有明顯的地理分布特性。

H地6個樣本內(nèi)生真菌的IF和所含真菌類群的Margalef（）、Shannon-Wiener（）以及均勻度指數(shù)（）均比對應(yīng)F地的低（表2和表3），表明F地內(nèi)生真菌要比H地更加豐富和多樣。兩地水稻種子樣本內(nèi)生真菌類群屬水平上為0.57，為中等相似（表4），并且Fisher精確檢驗結(jié)果顯示二者分析兩地真菌菌群組成差異顯著（＜0.05）（表5），表明水稻種子內(nèi)生真菌群落的組成在一定程度上受地理環(huán)境影響。

2.2.2 親本品種及其PTN近等基因系種子內(nèi)生真菌分布的地域差異比較 按地域分組計算RF值比較兩地樣本的內(nèi)生優(yōu)勢菌屬（RF＞10%，圖3），是兩地水稻種子共有優(yōu)勢菌屬。H地樣本有3個優(yōu)勢菌屬，其中菌屬在F地樣本中豐度降為常見菌屬，在F地未檢出。F地獨有優(yōu)勢菌屬和廣泛存在于6個樣本中（表2），可見不同種植地域水稻種子內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群組成存在差異。

表2 不同種植地水稻種子內(nèi)生真菌分離頻率比較（IF）（%）

HP1L和FP1L：海南省和浙江省富陽市種植的P1近等基因系，包括親本品種P1及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系T16和非轉(zhuǎn)基因組培對照株系NR25；HP2L和FP2L：海南省和浙江省富陽市種植的P2近等基因系，包括親本品種P2及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系T23和組培對照株系NR18；—：未檢出。下同

HP1L and FP1L: P1 near-isogenic line planted in Hainan and Fuyang, Zhejiang, containing parent variety P1, and its corresponding genetically modified line T16 and non-transgenic control line NR25 regenerated from tissue culture; HP2L and FP2L: P2 near-isogenic line planted in Hainan and Fuyang, Zhejiang, containing parent variety P2, and its corresponding genetically modified line T23 and non-transgenic control line NR18 regenerated from tissue culture; —: no detection. The same as below

圖3 海南?。℉）和浙江省富陽市（F）種植水稻種子內(nèi)生真菌的相對分離頻率（RF）

表3 海南?。℉）和浙江省富陽市（F）種植的PTN近等基因系水稻種子內(nèi)生真菌菌群多樣性指數(shù)

P1L：P1近等基因系，包括親本品種P1及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系T16和非轉(zhuǎn)基因組培對照株系NR25；P2L：P2近等基因系，包括親本品種P2及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系T23和組培對照株系NR18；—：未檢出。下同

P1L: P1 near-isogenic line, containing parent variety P1, and its corresponding genetically modified line T16 and non-transgenic control line NR25 regenerated from tissue culture; P2L: P2 near-isogenic line, containing parent variety P2, and its corresponding genetically modified line T23 and non-transgenic control line NR18 regenerated from tissue culture ; —: no detection. The same as below

將兩地種植的2個PTN近等基因系共6個供試水稻樣本種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌菌群組成和多樣性指數(shù)匯總于表3。觀察相同品種水稻種植于不同地點時的種子內(nèi)生真菌類群豐富度和多樣性。對P1品種而言，HP1和FP1樣本表現(xiàn)為“無”和“有”的極端差異，可見天然親本品種P1種子內(nèi)生真菌類群分布受種植地域影響很大。將觀測樣本群體擴(kuò)大至P1近等基因系P1L，除均勻度指數(shù)（）外，浙江省富陽市種植的FP1L近等基因系分離的真菌株數(shù)、菌屬數(shù)、豐富度指數(shù)（）和多樣性指數(shù)（）都高于相應(yīng)海南省種植樣本（表3），這與上述H和F兩種植地所有水稻樣本的內(nèi)生真菌多樣性變化趨勢一致。對P2品種而言，雖然FP2分離的內(nèi)生真菌株數(shù)和屬數(shù)比HP2多，但多樣性指數(shù)均低于相應(yīng)的HP2樣本；將觀測樣本群體擴(kuò)大至P2近等基因系P2L，F(xiàn)P2L分離的內(nèi)生真菌株數(shù)和菌屬數(shù)仍比HP2L多，Margalef（）指數(shù)1.52也大幅高于海南省種植HP2L群體的0.30。

2.3 不同品種水稻種子內(nèi)生真菌的多樣性比較

綜合表2和表3結(jié)果可分析不同樣本間種子內(nèi)生真菌的組成和分布差異，探測水稻種子非預(yù)期變異的特征和變異來源。以親本品種P1和P2為比對組，分析天然水稻品種之間種子內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性變異程度。

海南省種植地樣本中，HP1未檢出真菌，HP2分離到內(nèi)生真菌6株，歸為、、、和5個屬（表2）。可見在海南省種植時P2品種內(nèi)生真菌類群比P1豐富得多。浙江省富陽市種植地樣本中，F(xiàn)P1分離37株內(nèi)生真菌歸為9個屬，F(xiàn)P2獲得10株內(nèi)生真菌歸為6個屬，F(xiàn)P2的IF（8.26%）顯著低于FP1（30.58%）。、、和4個為FP1特有菌屬，為FP2特有菌屬；FP1和FP2共有菌屬5個，包括、、、和。FP2內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)Margalef（）、Shannon-Wiener（）以及均勻度指數(shù)（）均低于FP1，下降幅度分別達(dá)27.08%、39.39%和25.00%，說明浙江省富陽市種植的P1品種內(nèi)生真菌類群比P2更豐富多樣。

綜合兩地，在屬水平，P1和P2之間種子內(nèi)生真菌菌群的相似性系數(shù)（）分別為0（H）和0.67（F）（表4），表現(xiàn)極不相似和中等相似；近等基因系P1L和P2L之間內(nèi)生真菌菌群的分別為0.62（H）和0.74（H），為中等相似，F(xiàn)isherexact test檢驗顯示二者差異均不顯著（＞0.05）（表5）。

在內(nèi)生真菌類群組成上，HP2和FP2樣本都分離出了和，說明這兩個菌屬是P2品種的固有菌屬，只是菌屬豐度因地域而表現(xiàn)不同，F(xiàn)P2中菌屬的IF（1.65%）是HP2的2倍（表2）。綜合表2和表3，可知HP2中的3個菌屬、、和FP2中的等4個菌屬在水稻種子內(nèi)定植主要受地域影響。對P1品種而言，只在F地分離到9個屬真菌，種植地域影響更為突出。

2.4 GM水稻種子內(nèi)生真菌的非預(yù)期變異特征

海南省種植的GM水稻株系T16（HT16）種子共分離7株內(nèi)生真菌，總IF為5.79%，歸為、、、和5個屬（表2），相應(yīng)親本HP1未檢出真菌，二者相似性系數(shù)為0，完全不等同。浙江省富陽市種植時，GM水稻株系FT16種子內(nèi)生真菌總IF（14.05%）極顯著低于相應(yīng)親本FP1（30.58%），豐富度指數(shù)（）、多樣性指數(shù)（）和均勻度指數(shù)（）也都低于FP1樣本。菌群結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)T16與FP1樣本共有、、和4個內(nèi)生真菌屬，未檢出FP1攜帶的、、、和菌屬，卻額外增加了2個特有菌屬和。FT16與FP1內(nèi)生真菌類群的相似性系數(shù)0.53，為中等相似（表4），且二者內(nèi)生真菌的組成不具有顯著差異（=0.23＞0.05，表5）。

海南省種植的GM水稻株系T23（HT23）種子內(nèi)生真菌總IF（2.48%）顯著低于親本對照HP2（4.96%）。菌群組成上，與親本HP2相比，HT23攜帶的3個菌屬中為新增特有菌屬，和與HP2所共有，此外未檢出HP2特有菌屬、和，二者的相似性系數(shù)為0.50，中等相似，且不具有顯著差異（表5）。浙江省富陽市種植的FT23樣本內(nèi)生真菌總分離率13.22%顯著高于FP2。FT23分離獲得6個屬共16株真菌，其中、、和4個菌屬與親本FP2共有，和為新增特有菌屬，比FP2減少了2個菌屬和。FT23種子內(nèi)生真菌類群與FP2的相似性系數(shù)0.67，中等相似，二者內(nèi)生真菌的組成差異不顯著（=0.05）。

綜合兩地樣本，GM水稻品系T16種子固有的內(nèi)生真菌只有屬，在H和F兩地的IF分別為1.65%和4.13%；T23種子固有的內(nèi)生真菌包括和。和是親本品種P2種子固有內(nèi)生真菌（表2）。

表4 不同種植地水稻PTN近等基因系樣本種子內(nèi)生真菌菌群的相似性系數(shù)（Cs）

表5 不同種植地水稻PTN近等基因系樣本種子內(nèi)生真菌菌群組成的差異性分析（P）

2.5 GM水稻種子內(nèi)生真菌類群的非預(yù)期變異技術(shù)來源解析

兩地種植的P1L和P2L近等基因系中，與相應(yīng)親本相比，2個GM株系種子內(nèi)生真菌總分離頻率（IF）在海南省和浙江省富陽市的變異方向相反，但在相同種植地時又分別與相應(yīng)組培對照NR株系變異方向相同（表2）。以T16為例，HT16種子內(nèi)生真菌總IF（5.79%）顯著高于HNR25（1.65%），變異方向一致只是大小不同，其中GM水稻品HT16種子內(nèi)生真菌分離頻率增加的變異效應(yīng)中轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)＞組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)。但浙江省富陽市種植時，F(xiàn)T16種子內(nèi)生真菌總IF（14.05%）比親本FP1降低的幅度顯著低于FNR25（9.09%），因此，推測HT16種子內(nèi)生真菌分離頻率降低的變異效應(yīng)中轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)＜組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)。對GM水稻品系T23而言，海南省種植的HT23和組培對照HNR18的種子內(nèi)生真菌總IF均顯著低于親本對照HP2（4.96%），二者變異方向一致而且HNR18樣本變異幅度更大，似乎這種內(nèi)生真菌總分離率降低的變異效應(yīng)來源于組織培養(yǎng)無性系變異。但浙江省富陽市種植的FT23樣本內(nèi)生真菌總IF13.22%極顯著高于FP2（8.26%），組培對照FNR18與FP2親本對照相同（表2），又可將該變異效應(yīng)歸因于轉(zhuǎn)基因插入突變。綜合2個種植地變異方向相反且技術(shù)來源不甚明確的分析結(jié)果，認(rèn)為GM水稻品系種子內(nèi)生真菌總IF的波動變異受種植地域環(huán)境影響較大，非預(yù)期變異效應(yīng)較小。

菌群組成和結(jié)構(gòu)上，HT16種子攜帶內(nèi)生真菌等5個屬，HNR25卻只有1個屬（表2）；FT16額外增加的2個菌屬和不存在于其相應(yīng)組培對照樣本FNR25中，說明T16種子定植真菌類群增加的變異主要為轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)。與FP1相比，F(xiàn)T16種子內(nèi)生真菌減少了等5個菌屬，組培對照樣本FNR25卻減少了7個菌屬，而且其中5個菌屬與FT16的一致，由此可知GM水稻株系T16種子內(nèi)生真菌類群的消減變異效應(yīng)為組織培養(yǎng)無性系變異。同理，HT23與親本HP2相比增加了1個菌屬并且該菌屬只出現(xiàn)在該樣本中，浙江省富陽市種植的FT23比親本FP2增加了和2個菌屬，這種內(nèi)生真菌菌屬增多的變異并未在相應(yīng)組培參照樣本中出現(xiàn)，可判斷變異來源于轉(zhuǎn)基因插入突變，需要重點關(guān)注。海南省種植的HT23比HP2減少3個菌屬、和，HNR18比HP2減少4個菌屬、、和浙江省富陽市種植的FT23與組培參照樣本FNR18一樣也減少了和2個菌屬，可知GM水稻品系T23種子內(nèi)生真菌減少的變異主要受組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)的影響。

2.6 不同樣本水稻種子內(nèi)生真菌分布的聚類分析及影響因素主次評價

在屬水平上，根據(jù)種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的種類和豐度進(jìn)行聚類分析（圖4），可見兩地種植的12個水稻樣本中，聚類距離最近的樣本組包括FNR25和FNR18、FT16和HP2、HP1和HNR25。分析樣本具體來源可知，HP1和HNR25為海南省種植的P1品種及其組培品系，遺傳關(guān)系相近外；FNR25和FNR18對應(yīng)P1和P2品種來源的組培品系之間；FT16和HP2分別屬于不同近等基因系、不同種植地域、GM水稻品系和天然親本P2，實際遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可見種子內(nèi)生真菌類群分布受品種、種植地、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)改良的綜合影響。在根據(jù)樣本聚類的3個大組中，除FP1內(nèi)生真菌類群和豐度最大單獨歸為一個大組外，F(xiàn)P2/FT23/FNR25/FNR18/FT16/HP2歸為一組，HT16/HT23/HNR18/HP1/HNR25歸為另一組，后2個大組近似于種植地域的樣本集合，說明種植地域的影響較大。

圖4 海南?。℉）和浙江省富陽市（F）種植的6個水稻樣本種子內(nèi)生真菌組成的聚類分析

綜合分析兩地種植的2個PTN近等基因系共12個樣本的變異情況，將變異幅度峰值采取同向取高，反向絕對值相加的計算方法，得出最大變異幅度并根據(jù)大小進(jìn)行排序，真菌總分離頻率（IF）排序結(jié)果：P1和P2品種兩種植地之間變異幅度3.30%—30.58%（30.58%）＞P1和P2品種之間-22.32%—4.96%（27.28%）＞NR株系變異幅度-21.49%—1.65%（23.14%）＞GM株系變異幅度-16.53%—5.79%（22.32%），可見種植地域差異對水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌分離頻率的影響最大，品種影響其次，組培技術(shù)的變異效應(yīng)較小，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的變異效應(yīng)最小。從攜帶內(nèi)生真菌的總屬數(shù)變異幅度排序結(jié)果：P1和P2品種兩種植地之間變異幅度1—9（9）＞P1和P2品種之間-3—5（8）=NR株系變異幅度-7—1（8）=GM株系變異幅度-3—5（8），可見在屬水平上，種植地域差異對水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌類群組成的影響最大，其他3個因素的影響較小且相當(dāng)。

3 討論

“實質(zhì)等同性”原則一直是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要指標(biāo)，尚未見基于種子內(nèi)生菌評估GM作物非預(yù)期變異的研究報道。植物內(nèi)生菌與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，進(jìn)而可能影響農(nóng)作物的產(chǎn)量以及食用安全。有研究表明和能抑制胚芽生長，并且減少洋蔥根分生組織的有絲分裂指數(shù)[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌絕大多數(shù)為子囊菌綱，并且為海南省和浙江省富陽市兩種植地的優(yōu)勢菌屬（圖3）。Tian等[14]也發(fā)現(xiàn)為稻米中常見菌株。是水稻惡苗病的病原體[15]，也可能產(chǎn)生威脅食品安全的真菌毒素[16]。本研究發(fā)現(xiàn)地域?qū)?nèi)生真菌的影響較為明顯，H和F兩地內(nèi)生真菌菌群的組成既有共性，又存在一定的差異。作為H地特有優(yōu)勢菌株未在F地中分離得到，和作為在F地特有的優(yōu)勢菌株存在于6個稻米樣本中（表2），表明內(nèi)生真菌的分布具有地域的?；裕瑑?yōu)勢菌群也隨著地理環(huán)境的變化而改變。這與李盼盼的研究結(jié)果一致[11]。并且F地6個樣本中的IF、豐富度指數(shù)（）、多樣性指數(shù)（）以及均勻度指數(shù)（）均高于H地，表明F地稻米內(nèi)生真菌更加豐富，薛慶婉等[17]研究也發(fā)現(xiàn)地理環(huán)境是影響植物內(nèi)生真菌組成、豐富度和優(yōu)勢菌群的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)H和F地水稻種子內(nèi)生真菌的組成存在顯著性差異，差異的原因可能涉及土壤化學(xué)成分組成[14]，環(huán)境條件和氣候的影響[13]。

理論上，GM水稻種子的非預(yù)期變異效應(yīng)包括公認(rèn)安全的組織培養(yǎng)無性系變異和風(fēng)險性較大的轉(zhuǎn)基因插入突變，技術(shù)來源分別為GM株系培育過程中的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因插入整合。同等條件下，本研究PTN樣本系統(tǒng)中NR的性狀表現(xiàn)可作為解析GM水稻品系非預(yù)期變異技術(shù)來源的有效參照[2]。在H和F種植地中，某些菌屬表現(xiàn)明顯的品種特異性，如為P2特有菌株（表2），原因可能與水稻品種的遺傳背景相關(guān)，也可能受感染種子從母代到子代的垂直遺傳[18]。GM水稻T16和T23種子內(nèi)生真菌分離頻率的變異效應(yīng)即包括組織培養(yǎng)無性系變異，又包括轉(zhuǎn)基因插入突變，但變異幅度顯著小于P1品種的種植地域差異，也小于浙江省富陽市種植地的FP1和FP2的品種間變異（表2）。可推定GM水稻品系種植內(nèi)生真菌IF的變異幅度在安全范圍內(nèi)。與相應(yīng)親本相比，F(xiàn)T16額外增加2個菌屬和，HT23與親本HP2相比增加了1個獨有菌屬，F(xiàn)T23比親本FP2增加了和2個菌屬，基于PTN系統(tǒng)分析可知這些內(nèi)生真菌菌屬種類增多的變異均來源于轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)，需要重點關(guān)注其安全性。

與前人關(guān)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)對包括水稻在內(nèi)的植物根際土壤真菌群落、根際細(xì)菌群落和根內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不明顯[19-22]的報道不同，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)均能顯著影響水稻種子內(nèi)生真菌類群的結(jié)構(gòu)。兩地種植的PTN系統(tǒng)樣本的最大變異幅度排序結(jié)果可知種植地域?qū)λ痉N子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌豐度和類群組成的影響最大，品種影響次之，組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)影響較小，轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)的影響最小。這與前人對GM馬鈴薯和GM水稻根際微生物群落分布的研究結(jié)果類似，與種植地點、土壤類型、植物生長階段、植物品種相比，轉(zhuǎn)基因插入突變對馬鈴薯根際細(xì)菌群落的影響較小，其中種植地域影響要大的多[22-25]。結(jié)合聚類分析（圖4）和P1品種在海南省和浙江省富陽市種植時種子內(nèi)生真菌多樣性和豐富度的極端差異表現(xiàn)（表2），可明確種植地域?qū)λ痉N子內(nèi)生真菌類群的影響最為顯著。

4 結(jié)論

水稻種子內(nèi)生真菌豐富多樣，可培養(yǎng)內(nèi)生真菌絕大多數(shù)為子囊菌綱。不同種植地域水稻種子內(nèi)生真菌菌群組成存在差異，為海南省和浙江省富陽市兩種植地的水稻種子的共有優(yōu)勢內(nèi)生菌屬。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)均顯著影響水稻種子內(nèi)生真菌類群的結(jié)構(gòu)，其中GM水稻種子內(nèi)生真菌菌屬種類增多的變異主要來源于轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)，需評估其安全性。對水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌豐度和類群組成的影響大小排序為種植地域＞品種差異＞組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)＞轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)。

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ZHAO Yan, WANG Tianqi, ZHU JunLi

(College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018)

【】To provide scientific bases for study of the unintended variation in seed endophytic fungi community structure of genetically modified (GM) rice and explore the causing factors of variation, comparative analysis of the richness and biodiversity of seed endophytic fungi were conducted, using GM rice relative near-isogenic lines of different varieties in different cultivation sites as materials. 【】Collect transgenic rice line which harboring the glyphosate resistantgene (T)and its corresponding parent variety (P) and non-transgenic tissue culture regeneration control line (NR) to make parent control-transgenic plant line-non-transgenic control (PTN) near-isogenic line. The parent japonica rice Nipponbare (P1) and its corresponding transgenic line T23 and the NR control line NR18 formed the P1 near-isogenic line (P1L), the P2 near-isogenic line (P2L) composed of parent japonica rice PJ574 (P2) and its corresponding transgenic line T23 and the NR control line NR18. All rice samples were planted in two plantations including Hainan province (H) and Fuyang city of Zhejiang province (F) and the resulting seeds were harvested. The rice endophytic fungi were isolated by tissue separation method, strains were classified and identified with morphology and molecular biology methods. The isolation rate (IR), isolation frequency (IF), richness Margalef index (), diversity Shannon-Wiener index () and Evenness index () were used to reflect the structure and distribution of rice seed endophytic fungi, and Sorenson similarity coefficient () and Fisher’s exact test were employed to describe the composition difference of endophytic fungi between rice samples. 【】A total of 121 endophytic fungi strains were isolated from rice seed samples of P1L and P2L near-isogenic lines that harvested in Hainan (H) and Zhejiang (F) plantations, they were identified as 15 genera, of which,,,were confirmed as the dominant flora, withas the common dominant genus of both H and F plantations. The total RF (4.61%) of endophytic fungi from Zhejiang-grown rice seeds is 5.05 times than that of Hainan-grown rice samples (0.83%). The richness Margalef index (=2.29), Shannon-Wiener diversity index (1.63) and Evenness index (0.66) of endophytic fungi flora from rice seeds in F plantation were higher than that (=1.67,0.63,0.29) of samples in H plantation. The seed endophytic fungi communities of P1L and P2L in H plantation had a similarity coefficient of 0.615, and that was 0.737 in F plantation, showing moderate similarity, and the Fisher’s exact test analysis suggested that there were no significant difference (＞0.05) between them. The GM lines except HT16 showed moderate similarity to their corresponding parent controls referring seed endophytic fungi communities, with similarity coefficient ranged between 0.500 and 0.667. But compared with their corresponding parents, the GM rice lines showed notably unintended variations in IF and genus numbers of endophytic fungi, the variation direction and amplitude of IF varied between different plantations. Also, the GM line FT16 increased 2 additional fungi generaand, HT23 and FT23 respectively added 1 genusand 2 genera includingand. These genera increasing variations of endophytic fungi in GM rice seeds were derived from transgenic insertion mutation, whose safety needs to be focused on. While the genera decreasing variations of endophytic fungi in GM rice seeds were derived from somaclonal variation of tissue culture, which were safer. The variationamplitudeorder oftotal IF of rice endophytic fungi were as follows. Difference between H and F plantations referring to P1 and P2 (30.58%)＞Difference between P1 and P2 varieties (27.28%)＞Variation of NR lines (23.14%)＞Variation of GM lines (22.32%). The genus numbervariations of rice endophytic fungi ranked as follows. Difference between H and F plantations referring to P1 and P2 (9)＞Difference between P1 and P2 varieties (8)Variation of NR lines (8) = Variation of GM lines (8). 【】Rice seeds have abundant and diverse endophytic fungi, with majority of the culturable stains belong to Ascomycetes. Composition of rice seed endophytic fungi community shows geographical differences, andis very common dominant genus in rice seeds grown both in Hainan and Zhejiang. The structure of endophytic fungi flora in rice seeds are affected by transgenic manipulation as well as tissue culture technology, while their unintended variation effects are less than that of rice growing locations and variety differences. The genera increasing variations of endophytic fungi in GM rice seeds are derived from transgenic insertion mutation, and the safety needs to be assessed.

transgenic rice seed; culturable endophytic fungi; unintended variation; PTN system; diversity

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.016

2019-10-09；

2020-02-18

國家自然科學(xué)基金（31772100）

趙艷，Tel：0571-28008970；E-mail：yanzhao9918@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）