小麥表皮蠟質(zhì)脂肪醇合成基因 TaFAR10的克隆及功能驗證

劉曉宇,吳洪啟,石善黨,李春蓮,汪 勇,王中華

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

小麥是世界上重要的糧食作物之一，為全球五分之一的人口提供食物，其穩(wěn)產(chǎn)與高產(chǎn)具有重要意義。近年來，全球氣溫升高嚴重影響著小麥的生長和產(chǎn)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，植物表皮蠟質(zhì)覆蓋于植物最外層，與外界直接接觸，并形成了一道天然的疏水屏障，不僅具有防止非氣孔性水分散失、提高植物光合效率的作用，還具有保護植物免受外來機械損傷、病蟲害入侵、紫外線灼傷等作用[2-6]。因此，研究蠟質(zhì)合成相關基因的功能能夠為提高小麥的抗逆性和產(chǎn)量奠定一定的基礎。植物表皮蠟質(zhì)由超長鏈脂肪酸及其衍生物如初級醇、次級醇、烷烴、酯類、醛類、單酮和二酮等組成，一些物種的表皮蠟質(zhì)中還含有三萜類和酚類[7-9]。植物表皮蠟質(zhì)在不同生長時期、不同器官中的含量和組成存在很大差異[8-9]；其成分和含量也受環(huán)境影響，如光照、水分、溫度等[10-12]。植物表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)主要有片狀、柱狀、管狀、光滑薄膜狀等,這些蠟質(zhì)晶體覆蓋在植物葉片或者莖上，形成白霜狀或者灰白狀蠟質(zhì)層[13]。

目前，對擬南芥表皮蠟質(zhì)的合成途徑研究已較為清楚，首先是在質(zhì)體中形成脂肪酸前體，然后這些脂肪酸前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中延伸為超長鏈脂肪酸，最后經(jīng)過?；€原途徑將超長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為初級醇和酯，或者經(jīng)過脫羰途徑將超長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為烷烴、次級醇、酮等[7,14-15]。初級醇的合成存在兩種說法，在甘藍中，首先是依賴NADH的脂肪?；o酶A還原酶將脂肪酸還原為醛，然后依賴NADH的醛還原酶將醛轉(zhuǎn)換為初級醇[16]；玉米gl5突變體的表型化學分析也證明了這兩個過程的存在[17]。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在豌豆的葉片中能夠利用單一的酶直接將超長鏈脂肪酸還原為初級醇[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，CER4、FAR2、FAR1、FAR4、FAR5和FAR6均能夠直接將脂肪酸還原為初級醇[19]。普通小麥的植株表面覆蓋有豐富的蠟質(zhì)層，初級醇是小麥表皮蠟質(zhì)的重要組分之一[20]。目前小麥蠟質(zhì)合成的分子機制還不是很清楚，有研究在小麥突變體中精細定位了兩個與蠟質(zhì)合成相關的基因Iw1和Iw2，并且推測這兩個基因可能抑制β-二酮的合成[21-22]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TaFAR1、TaFAR2、TaFAR3、TaFAR4和TaFAR5/TAA1b參與小麥表皮蠟質(zhì)初級醇的生物合成[20,23-25]。

有研究表明，小麥花藥絨氈層細胞中特異表達的TaTAA1a基因能夠調(diào)控脂肪醇的產(chǎn)生[25]，但是該基因是否參與小麥葉片表皮蠟質(zhì)成分中初級醇的生物合成仍不清楚。為探究這一問題，本研究擬從小麥品系CP98(11)中克隆該基因，并通過序列分析、酵母異源表達、脅迫處理等方法，對該基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達模式等進行研究和分析，以期為進一步理解小麥葉片表皮蠟質(zhì)合成途徑的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗材料為普通六倍體小麥CP98(11)(低蠟品系)和其他表型差異的材料，其中，A14、靜2001、CP98(11)為低蠟品種，陜墾99(46)、明988、9(54)為高蠟品種，種植于西北農(nóng)林科技大學科研試驗田。為了檢測非生物脅迫條件下基因的表達量，將CP98(11)種植于西北農(nóng)林科技大學科研溫室，生長45 d左右后將材料小心取出，用自來水將基質(zhì)沖洗干凈，將沖洗好的材料置于洗干凈的燒杯中，加入適量自來水，在原來生長環(huán)境下恢復兩天。將材料從燒杯中取出，用濾紙將根上的水吸干，分別進行以下處理：暴露于空氣中進行干旱處理；放在裝有500 mL 20% PEG 6000中；放在100 μmol·L-1ABA中；放入裝有500 mL自來水的燒杯中并置于4 ℃環(huán)境下。

1.2 小麥總RNA的提取

在四葉期取小麥葉片，在小麥開花期取不同的器官，使用Trizol法提取小麥總RNA。

1.3 cDNA第一鏈的合成

取3 μg總RNA，按照Prime Script 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genstar)說明書進行cDNA第一鏈的 合成。

1.4 目的基因的克隆

根據(jù)小麥中的TaFAR4基因序列，分別在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast?db=core)的小麥數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN搜索，找到了與TaFAR4相似性較高的基因TaTAA1a，對其進行克隆。利用Primer Premier 5設計引物F1/R1(ATGGTTGACACACTGAGTGAAGAGA/TC ACTTGAGCATGTACTTTATGACC)，由生工(Sangon)生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.3中得到的cDNA為模板，利用引物F1/R1進行PCR擴增。擴增體系(50 μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，dNTPs(2 mmol·L-1)10 μL、ddH2O 10 μL，KOD FX(1.0 U·μL-1)1 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性 10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在150 V、200 mA的條件下，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒(Genstar)回收并純化目的片段,加入rTaq酶和dNTPs,72 ℃保溫30 min，完成末端加A。末端加A的基因片段與pMD18-T(TaKaRa)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)過抗性篩選，挑取單克隆，搖菌后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測序，使用軟件DNAMAN對測序結(jié)果進行多序列比對。

1.5 pYES2載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)釀酒酵母表達載體pYES2和目的基因的編碼區(qū)序列，設計帶有酶切位點的引物F2/R2(AGGGAATATTAAGCTTATGGTTGACACA CTGAGTGAAGAGA/GATATCTGCAGAATTCTCACTTGAGCATGTACTTTATGACC(下劃線為酶切位點)；以帶有目的基因的pMD18-T為模板，利用引物F2/R2擴增目的基因帶有酶切位點的完整編碼序列,將擴增得到的片段和pYES2載體經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)過菌落PCR和測序鑒定，確定目的基因序列無堿基突變后，將重組載體和空載體pYES2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母(INVSc1)菌株中，利用尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura)篩選陽性單克隆。酵母的轉(zhuǎn)化方法參照Gietz和Woods[28]。

1.6 酵母蠟質(zhì)的提取及其色譜分析

酵母蠟質(zhì)的誘導和提取參照Wang等[27]的方法，將提取的酵母表達產(chǎn)物用正己烷回溶并轉(zhuǎn)入氣相色譜分析瓶中。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS-QP2010，日本島津公司)對酵母提取物進行檢測。檢測條件為：載氣為氦氣(He)，進樣量1 μL，進樣口溫度280 ℃，分流比為2∶1，檢測器溫度320 ℃，掃描離子50～600 amu。升溫程序為：50 ℃保持2 min，以20 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持2 min，再以1.5 ℃·min-1升溫至320 ℃，保持15 min。各化合物因沸點不同得到分離，根據(jù)計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中醇、酸、醛、酯等化合物的特殊離子峰對酵母提取物進行鑒定。

1.7 目的基因序列分析

利用DNAStar 軟件包的EditSeq程序和ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 尋找最大的開放閱讀框；在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 對核苷酸序列進行BLAST分析；運用SMART(http://smart.Embl-heidelberg.de/) 和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 對蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進行分析；運用DNAMAN 8.0軟件對氨基酸序列進行同源比對；使用MEGA 6.0 構(gòu)建蛋白進化樹。

1.8 實時熒光定量PCR分析

在比較小麥其他FAR基因序列基礎上，對目的基因序列設計特異的實時熒光定量PCR引物(F/R：TGGCTTCCTTCCACCTATTT/TA CTTGCGTGCTTGGTCGTG)，內(nèi)參為小麥TaActin(F/R：TGTTGTTCTCAGTGGAGGTTCT/CTGTATTTCCTTTCAGGTGGTG)。實時熒光定量PCR體系為20 μL，按照試劑盒2 × Realstar Power SYBR Mixture(Genstar)說明書進行擴增，反應程序為95 ℃預變性 60 s；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。反應在ABI PRISM 7700 熒光定量PCR儀上進行(Applied Biosystems)。每個樣品4次重復，采用2-ΔΔCT法進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆及其序列分析

利用特異性引物F1/R1對小麥CP98(11)葉片cDNA進行目的基因的擴增，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到一條大小約1 500 bp的特異性條帶(圖1)。對特異性條帶進行切膠回收后，連接到pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后，選取三個陽性克隆進行測序，測序結(jié)果顯示，三個陽性克隆序列一致，大小為1 524 bp，且與報道的TaTAA1a序列一致，我們將其命名為TaFAR10。DNAMAN軟件分析顯示，該基因編碼的蛋白由507個氨基酸組成，進一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因的氨基酸序列中包含一個NAD(P)H 結(jié)合位點，一個活性位點和一個跨膜螺旋位點(TM,transmembrane)(圖2)。通過URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST)分析發(fā)現(xiàn)該基因位于小麥基因組的4B染色體長臂上。

M:DL2000(TaKaRa) ; 1～6:PCR擴增產(chǎn)物。

1和2分別代表FAR-N_SDR_e、FAR_C區(qū)域。

2.2 小麥 TaFAR10系統(tǒng)進化樹分析

利用TaFAR10的氨基酸序列與來自小麥和其他物種中的FAR氨基酸序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果(圖3)表明，19條氨基酸序列主要聚為兩大支，其中，TaFAR10、TaFAR4、TaTAA1c親緣關系較近，并且與擬南芥的AtFAR4聚為一類。TaFAR10與TaFAR4相似性達到95.27%，說明TaFAR10可能具有與TaFAR4相似的功能。

At：擬南芥；Ta：普通小麥；Os：水稻；Bd：二穗短柄草；Zm：玉米；Sb：高粱。

2.3 TaFAR10基因在酵母中的異源表達

按照1.5中提到的方法構(gòu)建酵母表達載體，將構(gòu)建好的重組載體和空載體pYES2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母(INVSc1)菌株中，利用尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura)篩選陽性單克隆，并按照Wang等[27]的方法進行誘導，從酵母產(chǎn)物中提取蠟質(zhì)成分，經(jīng)反應后，使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對其進行鑒定。結(jié)果顯示，與空載體相比，TaFAR10基因表達產(chǎn)物含有C18:0脂肪醇的離子峰(圖4)，表明TaFAR10基因具有合成C18:0脂肪醇的功能。

A：pYES2空載；B：pYES2- TaFAR10表達載體；C：酶產(chǎn)物； D：C18:0脂肪醇。

2.4 TaFAR10在不同組織及品種中的表達

由圖5可知，TaFAR10在旗葉、苗期葉片、葉鞘、穗下莖、穎殼、莖節(jié)、芒、花藥和根中均有表達，其表達量由高到低依次為：旗葉、苗期葉片、葉鞘、穗下莖、穎殼、莖節(jié)、芒、花藥、根。該基因在以上組織中的表達量分別是根的80.7、53.8、19.8、19、13.2、10.8、6.1和5倍。說明TaFAR10基因主要在旗葉和苗期葉片中大量表達。推測TaFAR10基因在小麥葉片表皮蠟質(zhì)合成途徑中起著重要的作用。

圖5 TaFAR10在不同組織表達的qRT-PCR分析

對小麥品種A14、靜2001、CP98(11)、陜墾99(46)、明988、9(54)進行定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，TaFAR10基因在各品種中均有表達，但其在高蠟品種中的表達量明顯高于低蠟品種(圖6)。

圖6 TaFAR10基因在不同小麥品種中的表達分析

2.5 非生物脅迫條件下 TaFAR10表達的分析

對生長一個月的苗期小麥進行干旱、PEG 6000、ABA和4 ℃脅迫誘導表達分析，結(jié)果(圖7)表明，TaFAR10在ABA、干旱和PEG脅迫條件下表達情況基本一致，在處理2 h內(nèi)表達量變化不明顯，2 h以后明顯地受到抑制，雖然其表達量在ABA和干旱處理2 h內(nèi)均有所增加，但都沒有達到顯著性水平；而在4 ℃脅迫條件下，TaFAR10的表達一直受到抑制。推測TaFAR10并不能受非生物脅迫誘導。

3 討 論

FAR基因作為超長鏈脂肪醇合成過程中的關鍵基因，對初級醇的形成有著決定性作用。目前在擬南芥、小麥中克隆到了部分FAR基因，并對其功能進行了分析。在本研究中，我們通過同源克隆方法得到了含有完整編碼序列的小麥TaTAA1a基因，并將其命名為TaFAR10。該基因的開放閱讀框全長為 1 524 bp，編碼507個氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域分析表明，TaFAR10蛋白分別在N端和C端含有FAR-N_SDR_e和FAR_C結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)果都與已克隆得到的FAR基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相吻合[20,23-24]。Wang等[20,23-24]將TaFAR蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，我們推測TaFAR10蛋白可能也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這還有待于進一步的研究。進化樹分析結(jié)果顯示，TaFAR10基因與TaFAR4基因具有很高的同源性，推測TaFAR10可能具有與TaFAR4相似的 功能。

蛋白序列多重比對結(jié)果表明，TaFAR10在N端含有NAD(P)H結(jié)合位點，中間含有活性位點，在C端含有一個跨膜位點，并且這些關鍵的功能結(jié)構(gòu)域序列較為保守，且TaFAR10蛋白序列與其他TaFAR蛋白序列的活性位點氨基酸序列一致，說明TaFAR10蛋白與其他TaFAR蛋白的功能具有一致性，推測TaFAR10基因可能具有催化合成超長鏈脂肪醇的功能。

為了驗證TaFAR10具有合成初級醇的功能，我們將TaFAR10基因在酵母中表達，結(jié)果顯示，TaFAR10基因具有合成C18:0脂肪醇的功能。先前的研究發(fā)現(xiàn)，將CER4基因在酵母中表達可以合成C24:0脂肪醇和 C26:0脂肪醇[19]。將擬南芥的FAR1、FAR4、和FAR5轉(zhuǎn)入酵母中，發(fā)現(xiàn)這三個基因能夠利用不同或者相同的底物產(chǎn)生鏈長為C18:0到C24:0的脂肪醇[28]。將眼蟲的FAR基因轉(zhuǎn)化酵母后，發(fā)現(xiàn)該基因能夠合成C14:0脂肪醇和C16:0脂肪醇[29]。將荷荷巴的FAR基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)該基因具有合成C16:0脂肪醇和C18:1脂肪醇的功能[30]。將小麥中的TaFAR基因在酵母中進行異源表達，發(fā)現(xiàn)TaFAR1和TaFAR5基因可以合成C22:0脂肪醇，TaFAR2能合成C16:0-C20:0脂肪醇，TaFAR3能合成C22:0-C30:0脂肪醇，TaFAR4合成C22:0-C26:0脂肪醇[20,23-24]。這些研究充分證明了在酵母中進行異源表達可以驗證FAR基因的功能，不同小麥TaFAR基因?qū)Φ孜镏舅岬逆滈L偏好不同。TaFAR10與其他TaFAR所編碼的酶相比，底物范圍較窄，TaFAR10只能以C18碳鏈飽和脂肪酸為底物或者優(yōu)先還原C18:0脂肪酸。

A、B、C、D分別為 TaFAR10在ABA、干旱、PEG、冷脅迫條件下的表達情況，E、F為 TaFER-5B(陽性對照)在PEG和干旱脅迫條件下的表達情況。*：P<0.05；**：P<0.01。

初級醇是小麥旗葉表皮蠟質(zhì)的主要成分。Wang等[25]的研究表明，TaTAA1a基因在花粉發(fā)育過程中具有重要作用，在花藥組織中，該基因的產(chǎn)物只存在于絨氈層，并且僅在花粉粒外細胞壁形成的特定階段表達。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示，該基因的表達有助于脂肪醇的產(chǎn)生，但并未證明該基因是否參與表皮蠟質(zhì)的生物合成[25]。本研究表明，TaFAR10基因在酵母中具有合成C18:0脂肪醇的功能，而且在小麥旗葉和苗期葉片中均具有較高的表達水平，另外，TaFAR10基因在高蠟品種中的表達量明顯高于低蠟品種，而TaFAR10基因克隆自低蠟品種，說明該基因是小麥中普遍存在的一個基因，推測其在小麥葉片表皮蠟質(zhì)的合成過程中起著非常重要的作用。蠟質(zhì)的主要成分包括初級醇、烷烴、醛、酯等。花粉壁含有蠟酯和其他脂類形式的脂肪醇。研究已經(jīng)證實，一些有關蠟質(zhì)產(chǎn)生的突變體能夠影響花粉的發(fā)育或花粉育性[25]。由此推測，生物合成網(wǎng)絡的遺傳基礎在表皮和花藥組織之間可能是共享的。

植物表皮蠟質(zhì)能夠限制非氣孔性水分的喪失，從而在干旱條件下發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中蠟質(zhì)的組成以及蠟質(zhì)合成相關基因的表達均受干旱、鹽、ABA脅迫的誘導[31]。CER1是擬南芥中合成烷烴的一個重要基因，在干旱、ABA、NaCl脅迫條件下表達量顯著升高；CER6是擬南芥中一個極長鏈脂肪酸縮合酶，在ABA脅迫條件下表達量升高[32]。擬南芥中的DSO也能夠在高鹽、高糖、ABA脅迫條件下表達量顯著升高[33]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥中參與初級醇合成的基因TaFAR1和TaFAR5的表達受干旱、PEG、ABA和冷脅迫的誘導而上調(diào)表達[20,23]，TaFAR2、TaFAR3、TaFAR4的表達受PEG、ABA、鹽脅迫和冷脅迫的誘導[24]。而在本研究中，TaFAR10基因在ABA、干旱、PEG、4 ℃脅迫條件下，表達量整體呈下調(diào)的趨勢。目前，小麥蠟質(zhì)的合成途徑還不清楚，推測可能該基因在脅迫條件下的作用較小，也有可能該基因是蠟質(zhì)合成途徑中的一個微效基因，具體的分子調(diào)節(jié)機制還有待于進一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究從小麥4B染色體長臂上克隆了一個TaTAA1a基因，并將其命名為TaFAR10，該基因的ORF長為1 524 bp，編碼一個507個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有其他TaFARs共有的保守結(jié)構(gòu)域。酵母異源表達結(jié)果顯示，TaFAR10具有合成C18:0脂肪醇的功能。TaFAR10基因在旗葉、苗期葉片、葉鞘、穗下莖、穎殼、莖節(jié)、芒、花藥和根中均表達，在旗葉和苗期葉片中大量表達，呈現(xiàn)組織特異性。TaFAR10在低蠟材料中的表達明顯低于高蠟材料。在ABA、干旱、PEG 6000和4 ℃冷脅迫條件下，TaFAR10基因的表達量呈下降趨勢，表明該基因不能受非生物脅迫誘導。TaFAR10參與了小麥葉片表皮蠟質(zhì)脂肪醇的合成。