大麥EMS突變體庫構(gòu)建和突變體篩選

欒海業(yè)，徐 肖，陶 紅，臧 慧，張英虎，喬海龍，楊紅燕，陳 健，陳 和，沈會權(quán)

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇鹽城 224002)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上四大禾谷類作物之一，具有生育期短、抗病和耐逆(耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠)等特點，對氣候環(huán)境適應性較廣泛；大麥主要用途有飼料、麥芽啤酒、食糧及工業(yè)原料等，并且是青藏高海拔地區(qū)最主要的糧食作物。大麥是二倍體自花授粉作物，染色體數(shù)為2n=2x=14，基因組大小為5.1 Gb，目前大麥基因組圖譜已公布，2012年，多國科學家利用Illumina和Roche 454測序平臺，構(gòu)建了4.98 Gb的大麥基因組物理圖譜，并揭示了3.2×104個基因的排列順序和結(jié)構(gòu)[1]；2017年，國際大麥測序聯(lián)盟綜合運用染色體構(gòu)象作圖等多種最先進的測序和組裝技術(shù)，組裝出了迄今最完整的大麥基因組物理圖譜，并提供了3.9×104個基因的高可信度信息[2]。大麥具有遺傳背景簡單，遺傳轉(zhuǎn)化相對容易的特點，是麥類作物功能基因組研究的重要模式植物。

突變體庫的創(chuàng)建是植物功能基因組學研究的重要基礎(chǔ)，目前在擬南芥[3]、水稻[4]等模式作物上均已構(gòu)建了飽和的突變體庫，并利用突變體材料，克隆了大量的功能基因[5-6]。突變體庫的構(gòu)建還可以創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，豐富品種的遺傳多樣性，為新品種選育提供基礎(chǔ)材料。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)化學誘變技術(shù)是構(gòu)建植物突變體庫的重要方法之一，具有誘變效率高，染色體畸變率較低，且多為點突變等優(yōu)點，所以被廣泛應用于各種作物突變體庫的構(gòu)建[7]。孫玉龍等[8]通過EMS對高產(chǎn)、抗白粉小麥盛農(nóng)1號進行誘變，獲得174個突變穗系，在M3代中得到18個穩(wěn)定遺傳的株系，其中4個株系小穗性狀優(yōu)于盛農(nóng)1號；張 彬等[9]通過對糜子進行EMS處理，構(gòu)建了變異類型豐富的糜子突變體庫，篩選到104個形態(tài)性狀變異株系；霍朋杰[10]利用EMS對裸燕麥進行誘變處理，獲得了表型變異豐富的EMS誘變系，2 000個M2株系中，鑒定到196份表型突變材料，變異率為9.8%。不同作物突變體的獲得為作物功能基因的克隆及驗證提供了豐富的基礎(chǔ)材料。

目前國內(nèi)外已構(gòu)建了多個大麥EMS突變體庫并利用突變體開展了相關(guān)研究，如Caldwell等[11]對二棱大麥品種Optic構(gòu)建了2個EMS誘變突變體庫，獲得了大約20 000個M2株系，并對其中的9 216個株系進行了定向誘導基因組局部突變技術(shù)(targeting induced local lesions in genomes,TILLING)分析；齊新麗等[12]對美國大麥品種Tamalpais進行EMS誘變處理，構(gòu)建了表型變異豐富的突變體庫，并利用TILLING技術(shù)成功獲得了大麥茉莉酸受體基因(COI1)的突變體；呂瑞華等[13]利用EMS誘變技術(shù)，構(gòu)建了大麥品種西引2號的TILLING篩選群體，并利用該群體對大麥抗病基因(EDR1)的突變體進行了檢測。與擬南芥、水稻和小麥相比，大麥突變庫的構(gòu)建還遠沒有達到飽和狀態(tài)，尤其是我國構(gòu)建的大麥突變體庫還較少，嚴重阻礙了我國大麥功能基因組學的發(fā)展；要獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重要的功能基因，首先應以當?shù)赝茝V品種為材料自主構(gòu)建大麥突變體庫。本研究旨在利用抗黃花葉病的優(yōu)質(zhì)啤酒大麥品種蘇啤6號構(gòu)建大麥突變體庫，為大麥功能基因組學研究和遺傳育種提供新突變體材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大麥品種蘇啤6號由江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所利用浙皮1號為母本，用該所選育的單二大麥品種為父本，進行人工雜交組配，后經(jīng)連續(xù)多年系譜選育而成。該品種為弱春性中熟二棱皮大麥，幼苗半直立，分蘗力中等偏上，株型較緊湊，耐肥抗倒性好，大穗大粒，后期熟相好，麥芽品質(zhì)好，高抗大麥黃花葉病，目前是江蘇及周邊地區(qū)主栽大麥品種。

1.2 研究方法

1.2.1 EMS 誘變

選取籽粒均勻、飽滿的蘇啤6號種子6 000粒，用濃度為0.5%的EMS溶液浸泡，并在室溫條件下于振蕩器上350 r·min-1振蕩10 h，種子用流水沖洗3 h后，自然晾干。

1.2.2 誘變種子的種植及性狀調(diào)查

2015年11月將誘變種子播種于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所南洋試驗場，2016年6月收獲大約2 400個M1代單株。2016年11月每個單株種子種植1行，行長1.5 m，行距25 cm，株距 5 cm，并設(shè)野生型蘇啤6號為對照，對M2代株系表型進行全生育期調(diào)查記載，主要記錄幼苗生長習性、葉形、葉色、分蘗力、株高、抽穗期、抗病性、棱型和穗型等性狀，篩選形態(tài)明顯變異的突變株行(以下稱其為株系)。2017年11月將篩選出的變異材料繼續(xù)播種于試驗田中，鑒定其表型變異的穩(wěn)定性。

1.2.3 M2代表型突變頻率的計算

M2代突變頻率=M2代突變株系/M2代總株系×100%

2 結(jié)果與分析

本試驗用0.5%的EMS誘變處理大麥種子，萌發(fā)后的大麥幼苗生長明顯受到影響，出苗比對照約遲5 d左右，并有黃化及白化苗現(xiàn)象，M1代單株成活率大約為40%。2 400個M1突變單株自交獲得M2代，在正常播種條件下，對M2代株系的主要農(nóng)藝性狀及生物學性狀進行調(diào)查，結(jié)果表明，經(jīng)EMS誘變后，蘇啤6號產(chǎn)生了豐富的表型變異，在所調(diào)查的幼苗生長習性、葉形、葉色、分蘗數(shù)、株高、抽穗期、棱型和穗型等性狀中均發(fā)現(xiàn)了突變單株或株系(表1)。M2代共發(fā)現(xiàn)突變株系152個，突變頻率為6.33%。

2.1 幼苗習性突變

野生型蘇啤6號幼苗為半直立型，在調(diào)查的2 400個M2株系中，共發(fā)現(xiàn)36個株系的幼苗習性發(fā)生了5種類型(匍匐、白化、黃化、叢生、彎曲)的突變，總的突變頻率為1.43%(表1)。其中，幼苗匍匐型突變株系有3個，突變頻率為0.13%(圖1A)；幼苗發(fā)生白化死亡的株系有10個，突變頻率為0.42%；幼苗整個植株或整個生育期發(fā)生黃化的突變株系有15個，突變頻率為0.63%，該性狀在M3代可以穩(wěn)定遺傳(圖1B)；幼苗叢生型突變株系有6個，突變頻率為 0.25%(圖1C)；幼苗彎曲型突變株系有2個，突變頻率為0.08%(圖1D)。

A：幼苗匍匐；B：黃化苗；C：幼苗叢生；D：幼苗彎曲；E：野生型。

表1 EMS誘變M2代各種突變表型的突變頻率

2.2 葉片突變

在2 400個M2代株系中，共發(fā)現(xiàn)34個株系的葉片發(fā)生了葉片黃條、白條、紅綠葉、白葉耳、葉病斑、旗葉卷曲、無旗葉、寬窄葉以及無葉耳10種類型的變異，總的突變頻率約為1.42%(表1)。葉黃條突變發(fā)生在分蘗期，部分葉片的邊緣黃化，葉綠素含量明顯減少，拔節(jié)期后，黃化葉片逐漸轉(zhuǎn)為綠色，可以正常進行光合作用、抽穗和結(jié)實(圖2A)。葉白條突變出現(xiàn)在幼苗期，返青拔節(jié)后部分植株死亡，部分可以逐漸恢復(圖2B)。2個突變株系為紅綠葉突變，葉片同時具有綠色、白色和紅色，該性狀不能穩(wěn)定遺傳到M3代(圖2C)。白葉耳突變除葉耳顏色為明顯的白色外，其他性狀與野生型沒有明顯差別(圖2D)，M3驗證該表型能夠穩(wěn)定遺傳，M2群體中葉耳顏色正常植株與白葉耳植株的比例為3∶1。葉病斑突變有兩種類型，一種是全生育期葉片有褐色的類病斑(圖2E)，另一種為全生育期所有綠葉都有白色病斑(圖2F)，這些突變體均不會導致葉片及植株的死亡，都可以正常抽穗、結(jié)實，M3代驗證發(fā)現(xiàn)該突變表型均可以穩(wěn)定遺傳，后代無分離現(xiàn)象。旗葉卷曲突變表現(xiàn)為部分旗葉明顯變小卷曲(圖2G)，不利于光合作用的進行。無旗葉突變表現(xiàn)為植株部分分蘗的旗葉缺失(圖2H)，但能夠正常抽穗、結(jié)實，該性狀并不能穩(wěn)定遺傳。寬窄葉突變表現(xiàn)為葉片變寬或變窄：蘇啤6號野生型植株的旗葉平均葉寬為1.37 cm，寬葉突變體旗葉平均葉寬為2.75 cm(圖2I)；細葉突變體旗葉平均葉寬僅為0.72 cm(圖2J)，M3代驗證寬窄葉突變表型均可以穩(wěn)定遺傳，后代無分離。無葉耳突變材料無葉耳和葉鞘，葉片豎直向上生長，株型緊湊，是改良大麥株型的理想材料，通過對后代遺傳分析表明，該性狀能穩(wěn)定遺傳，為單基因隱性突變(圖2K)。

A：葉黃條；B：葉白條；C：紅綠葉；D：白葉耳；E和F：葉病斑；G：旗葉卷曲；H：無旗葉；I：寬葉；J：細葉；K：無葉耳；L：野生型。

2.3 莖稈突變

M2代株系中，有33個突變性狀與莖稈相關(guān)，突變頻率為1.38%。莖稈相關(guān)突變主要包括無蠟質(zhì)、多節(jié)多葉、株高異常、分蘗異常、莖稈異常及莖稈彎曲6種變異類型。野生型整個植株均覆蓋有白色的蠟質(zhì)，無蠟質(zhì)突變單株表現(xiàn)為葉片、莖稈或穗部蠟質(zhì)缺失(圖3A，B)。多節(jié)多葉突變體從拔節(jié)期至抽穗期，節(jié)間和葉片數(shù)目明顯多于野生型，蘇啤6號野生型主莖葉片的數(shù)目大約為10個，而該突變體的主莖葉數(shù)目可以達到15個，并且每個節(jié)間明顯變短，穗子變小，該性狀可以穩(wěn)定遺傳(圖3C)。株高突變表現(xiàn)為植株變高和植株矮化，蘇啤6號植株的高度為76 cm，高稈突變單株有85 cm左右，矮化突變單株大約有20 cm(圖3D)。分蘗突變表現(xiàn)為分蘗數(shù)減少或增加，部分單株僅有一個分蘗，部分單株有多個分蘗，分蘗數(shù)平均達到15個以上(圖3E)，并且該性狀可以穩(wěn)定遺傳。莖稈異常表現(xiàn)為一個分蘗有多個莖稈，穗子不能正常抽出，該性狀不能穩(wěn)定遺傳(圖3F)。莖稈彎曲突變主要表現(xiàn)為抽穗后穗子莖部扭曲(圖3G)，其他性狀與野生型沒有明顯差異。

A和B：無蠟質(zhì)；C：多節(jié)多葉；D：矮化；E：多分蘗；F：莖稈異常；G：莖稈彎曲；H：野生型。

2.4 穗部突變

M2代株系中發(fā)現(xiàn)了22個與穗子相關(guān)的突變體，突變頻率為0.92%(表1)，主要包括棱型、異常穗、球穗、淺黃穗、白穎殼、雙穗和穗長變異7種類型。野生型蘇啤6號為二棱皮大麥品種，突變材料中發(fā)現(xiàn)了六棱的突變株，并且能夠穩(wěn)定遺傳(圖4A)。異常穗突變棱型介于二棱與六棱之間，一個穗子中間部位有多排雜亂無章的籽粒，成熟后，還有部分籽粒無皮，為裸大麥(圖4B，C)。球穗突變表現(xiàn)為穗子變短、變圓，類似于球型，結(jié)實率降低(圖4D)。淺黃穗突變表現(xiàn)為灌漿期穗子的顏色為淺黃色，其他性狀與野生型相比，沒有明顯差異(圖4E)。白穎殼突變出現(xiàn)在抽穗至灌漿期，突變株穎殼的顏色為白色，穗子缺失葉綠體，后代驗證發(fā)現(xiàn)，該性狀可以穩(wěn)定遺傳，為單基因隱性突變(圖4F)。雙穗突變表現(xiàn)為莖稈上面有兩個穗子，M3代驗證表明該性狀不能穩(wěn)定遺傳(圖4G)。穗子長度突變表現(xiàn)為穗子變長或變短：野生型穗子長度為7.2 cm，長穗突變體平均長度為9.9 cm，穗粒數(shù)也明顯增多(圖4H)；短穗突變體籽粒變小，排列緊密，平均長度僅為4.35 cm(圖4I)。

2.5 生育期突變

經(jīng)EMS誘變后，部分大麥的抽穗期與成熟期均發(fā)生了較大的變化。M2代中有6個早抽穗株系，4個晚抽穗株系，突變頻率分別為0.25%和0.17%。M2代中有5個早熟株系，成熟期平均提前了5～10 d；有6個晚熟株系，成熟期平均推遲了4～7 d。

2.6 育性突變

M2代中共有6個株系的育性降低，其中有2個為完全不育，另外4個育性為10%～40%；開花期不育材料的穎殼膨大、張開，部分接受外部花粉，可以結(jié)實。有1個不育材料穎殼中的三枚雄蕊全部突變成了雌蕊(圖4J)。

A：異常棱型；B和C：異常穗；D：球穗；E：淺黃穗；F：白穎殼；G：雙穗；H：長穗；I：短穗；J：雄性不育；K：野生型。

2.7 純合突變體的農(nóng)藝性狀分析

對M3代穩(wěn)定的突變體株系進行主要農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果表明(表2)，突變?nèi)后w中，在抽穗期、株高、穗長、單穗穗粒數(shù)、總蛋白含量和總淀粉含量方面均產(chǎn)生了豐富的變異，抽穗期為208～ 227 d，株高為21.67～85.54 cm，穗長為4.53～10.9 cm，單穗穗粒數(shù)為14.25～72.52，總蛋白含量為12.42%～16.78%，總淀粉含量為 39.46%～ 53.42%；其中單穗穗粒數(shù)與穗長的變異系數(shù)較大，分別為31.02和13.81。通過EMS誘變處理，在主要農(nóng)藝性狀方面均產(chǎn)生了不同于野生型的突變體，為以后基礎(chǔ)理論研究及育種工作提供了基礎(chǔ)材料。

表2 M3代純合突變體株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

3 討 論

EMS誘變可以引起表型變異，目前，該技術(shù)已經(jīng)應用于擬南芥、水稻、小麥、糜子、燕麥和大豆等植物中，創(chuàng)制出了許多有價值的種質(zhì)資源，為作物重要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)特性等相關(guān)基因的克隆提供了材料基礎(chǔ)[3-4,8-10]。然而目前關(guān)于大麥功能基因組學的研究還處于起步階段，如Qin等[14]通過圖位克隆的方法，成功克隆了大麥品種鄂大麥6號階段性白化基因whs18。張曉勤等[15]對大麥浙農(nóng)大3號進行EMS誘變，得到1 300個M2株系，篩選出各種形態(tài)突變株系97個，突變率為 7.46%。本研究以優(yōu)質(zhì)的啤酒大麥品種蘇啤6號為材料，利用EMS誘變的方法構(gòu)建了大麥突變體庫，獲得2 400個M2代材料。對M2株系進行全生育期考察，篩選到152個突變株系，并發(fā)現(xiàn)了多個未見報道的突變類型，如大麥多葉、三枚雄蕊雌化等。該突變體庫的創(chuàng)建豐富了大麥突變體庫，為我國大麥功能基因組學研究和新品種選育提供了新的實驗材料。

葉色突變體是研究植物光合作用及光形態(tài)建成等代謝途徑的重要材料，在雜交育種中還可以作為重要的形態(tài)標記。水稻上已報道了190份葉色突變體，并克隆到了30個相關(guān)調(diào)控基因[16]。大麥上也有相關(guān)葉色突變體的報道，但克隆的相關(guān)調(diào)控基因還較少。秦丹丹等[17]通過EMS誘導鄂大麥934，篩選到一個整個生育期葉色都為淺黃色的突變體，并將葉色突變基因初步定位到3H的12.7 cM區(qū)間內(nèi)；Wang等[18]將受高溫誘導的大麥黃化基因vvy初步定位到4H的長臂上；本課題組前期發(fā)現(xiàn)了一個大麥白色穎殼突變體，并通過轉(zhuǎn)錄組學分析初步了解了其形成的分子機理[19]。本研究所構(gòu)建的蘇啤6號突變體庫中也發(fā)現(xiàn)多個葉色突變體，包括葉片黃化、白化、白條紋、黃條紋、紅色條紋、白葉耳和白穎殼等，今后將通過構(gòu)建遺傳群體，進一步研究這些突變的形成機理。

表皮蠟質(zhì)是覆蓋于陸生植物外部的一層有機化合物，對于植物適應各種逆境環(huán)境(干旱、病蟲害等)具有重要作用。在擬南芥、水稻和玉米等植物中已篩選到大量蠟質(zhì)缺失突變體，目前在擬南芥中已克隆出幾十個與蠟質(zhì)合成和調(diào)控相關(guān)的基因，為表皮蠟質(zhì)合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析奠定了基礎(chǔ)[20]。在麥類作物中，通過圖位克隆得到的蠟質(zhì)相關(guān)基因還較少，Li等[21]通過誘變得到了大麥葉片蠟質(zhì)缺失突變體cer-ym，表現(xiàn)出對干旱敏感，并利用F2群體將該基因初步定位到4H染色體上；Zhou等[22]將大麥葉片和穗部蠟質(zhì)缺失基因cer-b2定位到3H染色體1.3 cM區(qū)間內(nèi)。本研究共鑒定出各種蠟質(zhì)缺失突變體15份，并對穗部蠟質(zhì)缺失突變體和野生型進行了形態(tài)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組學分析，從細胞和分子水平上初步解釋了穗部蠟質(zhì)缺失性狀形成的機理[23]。

葉夾角是決定作物理想株型的重要因素之一，葉夾角大小與葉耳的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了2個無葉耳突變系，葉片與主莖間夾角明顯減小，葉片呈直立向上的形態(tài)，個體間對光能吸收的競爭減少，適合密植，有增產(chǎn)的潛力。在水稻和玉米上已有無葉耳突變體的相關(guān)報道[24-25]，并對相關(guān)基因進行了精細定位，可能與SBP轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，大麥上還未見相關(guān)基因被克隆報道。本研究還發(fā)現(xiàn)了1個雄蕊雌化突變系，穎殼內(nèi)的三枚雄蕊全部突變成了雌蕊，該突變體的發(fā)現(xiàn)對研究麥類作物花器官發(fā)育的分子機理以及不育系雜交育種研究都具有重要意義。

本研究對EMS誘變產(chǎn)生的突變株系的主要農(nóng)藝性狀進行了進一步的分析，發(fā)現(xiàn)了一批穩(wěn)定的優(yōu)良株系，比如矮稈、多葉(用于大麥青貯)、早熟和低蛋白等性狀優(yōu)良的突變株，這些優(yōu)異種質(zhì)資源可以直接應用到大麥育種中。