禾谷鐮刀菌 Tri8基因敲除及產(chǎn)毒類型分析

李添夢,胡小平，杜光源，范三紅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100)

赤霉病(Fusarium head blight)是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害[1]，該病害由禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)引起，不同地域復(fù)合種的組成有所不同。引起我國小麥赤霉病的主要病原菌為禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌，其中小麥玉米輪作區(qū)以禾谷鐮刀菌為主，小麥水稻輪作區(qū)以亞洲鐮刀菌為主[2-3]。赤霉病病原菌主要侵染小麥穗部，會引起籽粒發(fā)育不良，病原菌合成的毒素在籽粒中的累積，還會對人畜健康和食品安全造成嚴(yán)重威脅[4-6]。

禾谷鐮刀菌可以合成單端孢霉烯族的真菌毒素，常見的類型有4種：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)和雪腐鐮刀菌烯醇(nivalend,NIV)[7-8]，其中DON是帶病小麥籽粒中毒素的主要存在形式。DON毒素可以干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻礙核糖體的正常循環(huán)，從而抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[9]。大量攝入DON會引起急性中毒[10-11]，主要表現(xiàn)有頭疼、頭暈、嘔吐及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[12]。因而，赤霉菌毒素導(dǎo)致的食品安全問題引起國家管理部門及研究者的高度關(guān)注。

鐮刀菌中參與毒素合成的基因有12～16個[13]，命名為Tri基因，不同菌株參與的基因數(shù)目有所不同。這些基因主要集中在兩個基因簇中，其中最大的一個基因簇命名為Tri5，包含了Tri3、Tri4、Tri5、Tri6、Tri7、Tri8、Tri9、Tri10、Tri11、Tri12、Tri13和Tri14共12個Tri基因；另一個基因簇中包含了Tri1和Tri16兩個基因，Tri15和Tri101游離于上述基因簇之外[14]。DON生物合成的直接前體為法尼基焦磷酸(FPP)，在Tri5基因編碼產(chǎn)物的催化下，法尼基首先環(huán)化形成單端孢霉二烯(TDN)[15]；在Tri4編碼的P450家族單加氧酶催化下進行3次羥化反應(yīng)和1次環(huán)加氧反應(yīng)，形成異構(gòu)單端孢霉三醇[16-17]；該化合物可自發(fā)脫水環(huán)化形成異構(gòu)木霉菌醇；在Tri101、Tri11和Tri3編碼產(chǎn)物催化下進行1次羥基化和2次乙?；纬甥惓鄽ぞ?CAL)；CAL在Tri1編碼的P450羥化酶催化下，在7，8兩個位置引入2個羥基[18]，最終形成DON前體3,15-diAcDON；Tri8編碼分泌型酯酶，可催化3,15-diAcDON 3位或15位乙酰基的水解，從而形成3-AcDON或15-AcDON[19]，不同的鐮刀菌編碼的Tri8基因有所不同，有些可催化3位乙?；乃猓渌麆t催化15位乙?；乃鈁20]；3-AcDON或15-AcDON可自發(fā)，或在病菌或植物酯酶的催化下水解剩余的乙?；罱K形成DON。

研究表明，亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)主要產(chǎn)生3-AcDON和NIV類型毒素，而禾谷鐮刀菌(F.graminearum)主要產(chǎn)生15-AcDON[21]。其中NIV類型菌株產(chǎn)生的NIV毒素含量極低。本研究利用基因敲除技術(shù)獲得Tri8基因缺失的禾谷鐮刀菌株系，并對其產(chǎn)生毒素的類型進行了定性分析，以期為DON合成前體3,15-diAcDON的制備及Tri8蛋白體外活性分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H-1和農(nóng)桿菌菌株EHA105由本實驗室保存，載體pOSCAR和pA-HYG-OSCAR由本實驗室保存，PrimerSTAR DNA polymerase、PstI、BamHI、HindIII和XhoI購自Takara公司(大連)，DNA快速提取試劑盒(DSBIN1151)購自廣州東盛生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，無縫克隆試劑盒CloneExpressTM為南京諾唯贊生物科技公司?；旌隙舅貥?biāo)準(zhǔn)品購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司(北京)。

1.2 方 法

1.2.1 基因敲除載體構(gòu)建

利用CTAB法提取野生型禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1基因組DNA，以其為模板，利用引物Tri8-wf-uF/uR和Tri8-wf-dF/dR(表1)分別擴增Tri8基因上下游片段Tri8-up和Tri8-down，其長度分別為1 078 bp和1 213 bp。PCR反應(yīng)體系為：100 ng· μL-1的DNA模板0.5 μL、10 μmol·L-1的正反向引物各0.5 μL、2×Buffer 12.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTP 0.5 μL、1 U· μL-1的KOD酶0.5 μL、滅菌蒸餾水補足至25 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。利用PstI、BamHI酶切載體pA-HYG-OSCAR，并通過膠回收獲得1 425 bp的抗性基因片段HYG。

表1 引物序列

通過重疊PCR對上述三個片段進行連接(順序為Tri8-up、HYG、Tri8-down)。PCR反應(yīng)體系為：100 ng· μL-1的Tri8-up、Tri8-down和HYG基因片段各0.5 μL、2×Buffer 12.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 0.5 μL、1 U· μL-1KOD酶0.5 μL、滅菌蒸餾水補足至25 μL。前期PCR反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸3.2 min，5個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。以上反應(yīng)體系不加入引物，反應(yīng)結(jié)束后加入引物Tri8-wf-uF、Tri8-wf-dR各 0.5 μL，后期PCR反應(yīng)體系為；95 ℃變性5 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸3.2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。利用HindIII、XhoI對pOSCAR載體進行雙酶切，切膠回收并利用無縫克隆將其與通過重疊PCR獲得的Tri8-up-HYG-Tri8-down片段進行連接，轉(zhuǎn)化篩選最終獲得Tri8基因敲除載體pOSCAR-△Tri8。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將基因敲除載體pOSCAR-△Tir8轉(zhuǎn)至PH-1野生菌株，具體過程參考Zahi等[22]的報道。在陽性基因敲除菌株篩選過程中，首先利用引物HYG-F/R擴增HYG基因，初步判斷Tri8基因敲除是否成功，之后利用引物Tri8-F/R擴增Tri8基因，進一步確定Tri8基因是否成功敲除。

1.2.3 基因敲除菌株與原始菌株的產(chǎn)毒類性 分析

將對照菌株和Tri8基因敲除菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱活化3～5 d，挑取菌塊接種至CMC培養(yǎng)基中，25 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液用濾布過濾獲得孢子液。將孢子液加入大米培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng) 30 d，取出培養(yǎng)基液氮速凍后研磨至粉末狀，加入400 mL甲醇，200 r·min-125 ℃過夜抽提。將培養(yǎng)物用三層濾紙過濾，濾液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸餾，濃縮至50 mL，-20 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除載體pOSCAR-△ Tri8的構(gòu)建

Tri8基因敲除載體構(gòu)建流程如圖2所示。依據(jù)禾谷鐮刀菌基因組序列設(shè)計Tri8基因上下游擴增引物，并以基因組為模版擴增獲得上下游片段Tri8-up(1 078 bp)和Tri8-down(1 213 bp)。PstI、BamHI雙酶切pA-HYG-OSCAR質(zhì)粒，通過膠回收獲得潮霉素抗性基因編碼片段HYG(1 425 bp)。然后利用重疊PCR技術(shù)將三者連接獲得敲除片段Tri8-up:HYG:Tri8-down。HindIII、XhoI雙酶切pOSCAR載體，切膠回收獲得包含T-DNA左右邊界的載體，然后通過無縫克隆技術(shù)將其與敲除片斷連接，最終獲得敲除載體pOSCAR-△Tri8。利用PCR方法對敲除載體進行初步篩選，然后將陽性重組子送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序驗證。測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的敲除載體pOSCAR-△Tri8的序列與設(shè)計完全一致。

圖1 基因敲除載體pOSCAR-△ Tri8構(gòu)建流程

2.2 基因敲除株系的篩選與鑒定結(jié)果

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將敲除片段導(dǎo)入禾谷鐮刀菌PH-1中，利用同源重組機制將原有的Tri8置換為潮霉素抗性基因HYG。首先利用電激法將敲除載體pOSCAR-△Tri8導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，將其與鐮刀菌PH-1的孢子進行孵育，然后置于含有潮霉素的PDA平板進行篩選。提取陽性菌斑DNA，分別利用潮霉素抗性基因特異引物HYG-F/R和Tri8基因特異引物Tri8-F/R進行PCR擴增驗證，能擴增出HYG對應(yīng)片段而不能擴增出Tri8對應(yīng)片段的株系則為Tri8基因敲除株系PH-1-△Tri8。選取20個菌株提取基因組DNA進行PCR檢測，結(jié)果顯示大部分樣品均擴增出896 bp的潮霉素抗性基因特異條帶(圖2A)。但候選敲除菌株樣品6和18菌株菌絲較少，未成功提取其基因組DNA，故未成功擴增出896 bp的潮霉素抗性基因特異條帶。結(jié)果表明，除了野生菌株P(guān)H-1外，其他候選敲除菌株樣品中均未擴增出Tri8基因?qū)?yīng)的1 388 bp特異條帶(圖2B)，說明候選敲除菌株中(除樣品6和18)的Tri8基因已被HYG基因替換。

A:HYG基因擴增結(jié)果; B: Tri8基因擴增結(jié)果; M:1 kb DNA Ladder; 1:野生型菌株P(guān)H-1; 2～21:候選敲除菌株。

2.3 基因敲除株系的產(chǎn)毒類型檢測結(jié)果

按照材料與方法1.2.3所示流程對野生型菌株P(guān)H-1和Tri8基因敲除株系進行產(chǎn)毒培養(yǎng)，利用高分辨離子淌度液質(zhì)聯(lián)用儀對粗提液的組分進行定性分析。發(fā)現(xiàn)野生型菌株中出峰時間為 4.97～5.00 min 的DON為最主要成分，同時存在少量的3-AcDON或15-AcDON，其出峰時間為5.98～6.00 min(圖3A)；Tri8敲除株系中3-AcDON或15-AcDON含量最高，含有少量DON，在出峰時間6.48～6.51 min處出現(xiàn)第三個主峰，依據(jù)相對分子質(zhì)量判斷此峰為3,15-diAcDON。與野生型菌株相比，Tri8基因敲除株系不同菌株的DON相關(guān)組分含量變化一致，均出現(xiàn)一定程度DON前體3,15-diAcDON的累積。

A:野生型菌株P(guān)H-1; B: Tri8基因敲除菌株。

3 討 論

由于赤霉菌毒素會對人畜健康造成嚴(yán)重威脅，因而赤霉菌毒素生物合成、分泌及調(diào)控機制一直是赤霉病研究的熱點[24]。Tri8編碼一種分泌型酯酶，可將禾谷鐮刀菌合成并轉(zhuǎn)運至胞外的毒素前體3,15-diAcDON上的乙酰基水解移除，形成只包含一個乙?；难苌?5-AcDON或3-AcDON[19]，后者可自發(fā)或在其他病原菌或宿主酯酶作用下移除另一個乙?；?，最終形成DON。劉楊楊等[21]研究表明，PH-1菌株產(chǎn)毒類型主要為15-AcDON，即其Tri8編碼酯酶可催化雙乙酰前體3位乙?；乃狻１緦嶒灲Y(jié)果顯示，野生型菌株P(guān)H-1的毒素組分主要為DON，少量為 3/15-AcDON，而非理論上的以15-AcDON為主。表明在我們所給的實驗條件下[25]，大部分15-AcDON可進一步自發(fā)或在其他酯酶催化下水解剩余的15位的乙酰基形成DON。實驗結(jié)果同時顯示，Tri8基因敲除株系產(chǎn)生的毒素以3/15-AcDON為主，并存在少量DON和3,15-diAcDON，而非理論上以3,15-diAcDON前體為主?？紤]到野生型對照中大部分15-AcDON會因為自發(fā)或在其他病原菌或宿主酯酶作用下移除另一個乙?；D(zhuǎn)化為DON，因而突變體中大部分3,15-diAcDON被轉(zhuǎn)化為3/15-AcDON也在情理之中。無論如何上述結(jié)果都能說明，Tri8基因敲除會導(dǎo)致雙乙酰毒素前體的累積。

Tri8酯酶催化3,15-diAcDON乙?；猓荄ON毒素合成和活化的重要步驟，要闡明該酶的催化機制首選需要制備出該酶足夠的底物3,15-diAcDON。本研究創(chuàng)制Tri8基因缺失突變體的初衷就是為了讓3,15-diAcDON在培養(yǎng)基中積累，然后抽提、分離制備獲得3,15-diAcDON。從已有的結(jié)果來看，Tri8基因的敲除的確可以導(dǎo)致3,15-diAcDON的累積，但大部分又自發(fā)轉(zhuǎn)化為3/15-AcDON。在后續(xù)研究中應(yīng)進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，減少3,15-diAcDON的自發(fā)轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)3,15-diAcDON的大量累積，為后續(xù)Tri8基因結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用重疊PCR和無縫克隆技術(shù)構(gòu)建了禾谷鐮刀菌Tri8基因敲除載體pOSCAR-△Tri8，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化篩選鑒定出Tri8