響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡果皮中原花青素提取工藝

羅婭婷，崔現(xiàn)亮，熊雪娟，張國忠，李學(xué)玲

1.云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，普洱學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000

咖啡是世界上的主要飲品之一[1]?？Х燃庸ひ话悴捎脻穹庸?，在這一過程中會(huì)產(chǎn)生大量的咖啡果皮廢棄物[2]。據(jù)Emaille 和Saenger 研究報(bào)道指出，單咖啡果皮就約占成熟鮮果的43～50%，每1 噸干咖啡豆生產(chǎn)約產(chǎn)生1 噸咖啡果皮，而在半濕和濕加工過程中，咖啡果皮的量可達(dá)2 噸以上[3-4]。這些咖啡皮大多是隨意丟棄的，不但對環(huán)境造成污染還造成了原料的浪費(fèi)[5]。

咖啡果皮中富含許多有益成分如咖啡因[6]，花青素[5]，原花青素[7]，膳食纖維，粗蛋白和各種礦物質(zhì)等[8]。其中原花青素（Oligomeric proantho-cyanidins，OPC）在醫(yī)療保健，食品和化妝領(lǐng)域都有不同的應(yīng)用[9-10]。國內(nèi)對于原花青素的提取方法有很多，主要有：溶劑浸提[11]，超聲波提取、微波輔助提取等方法[11-12]，溶劑提取是一種較為簡便的方法，多利用乙醇、甲醇、水等溶劑用作提取劑，但對于咖啡果皮中原花青素的提取優(yōu)化工藝國內(nèi)外均未見報(bào)道。

隨著咖啡產(chǎn)量的提高，果皮廢棄物數(shù)量也隨之增加，咖啡果皮的開發(fā)利用是一個(gè)急需解決的問題[5]。通過響應(yīng)面分析法利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，能以用較少的試驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間對試驗(yàn)進(jìn)行全面研究，能在更為經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)次數(shù)下得到精確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并對因素及其交互作用的影響也可以進(jìn)行評價(jià)[14]。從而可以得到咖啡果果皮的優(yōu)化提取工藝，為咖啡果皮的開發(fā)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新鮮咖啡果：采摘于思茅區(qū)南屏鎮(zhèn)大開河村（海拔：1 023m；N22°35′35″；E101°0′47″），思茅區(qū)南屏鎮(zhèn)冬瓜嶺某種植基地（海拔：1 098m；N22°65′72″；E101°1′13″），普義鄉(xiāng)普治村農(nóng)戶家的咖啡地（海拔1 209m；N23°3′23″；E101°23′37″）三個(gè)地方，品種均為“卡蒂姆”系列，采樣遵循代表性，均勻性，隨機(jī)性原則，采取的每個(gè)樣品不低于2Kg。采回的鮮豆及時(shí)剝皮處理，避免發(fā)酵。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物科技有限公司

香草醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所

甲醇、乙醇、氫氧化鈉、硫酸均為分析純

30%硫酸甲醇配制：取350ml 甲醇，倒入燒杯，然后緩慢加入98%的濃硫酸，邊加邊攪拌。

3%香草醛甲醇配制：取30g 香草醛粉末置于1000ml 甲醇溶液中，不斷攪拌直至溶解。

1.2 儀器設(shè)備

721G-100 可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；YP-5002 電子天平：常州萬泰天平儀器有限公司；FA2004G 電子天平：常州萬得天平儀器有限公司；智能光照培養(yǎng)箱PGX-150；江蘇同君科技儀器有限公司；HHA-11-2 電熱恒溫水浴鍋：江蘇同君科技儀器有限公司；PHS-3CPH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CS-100A 型高速多功能粉碎機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的選擇及確定

試驗(yàn)樣品制備：將新鮮和曬干咖啡果按未熟、欠熟、成熟、過熟分別研磨或粉碎后取0.2g，以料液比1：70 加入80%乙醇，在70℃下水浴提取50min，過濾，濾液定容至50ml，待用。

咖啡果皮樣品中原花青素含量的測定（硫酸-香草醛法[16]）：(1)空白調(diào)零： 0.5ml 蒸餾水+30g/L 香草醛甲醇溶液2.5ml+30%硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 試管中, 在30℃黑暗條件下反應(yīng)15min[18]。（2）咖啡果皮提取液吸光值測定：0.5ml 咖啡果皮提取液樣液+30g/L 香草醛甲醇溶液2.5ml+30% 硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 試管中，30℃黑暗條件下反應(yīng)15min 后，在500nm 處測定吸光值A(chǔ)1[15-17]。（3）去除顏色誤差：在樣品提取液中存在的色素在500nm處有吸收，消除樣品本底與顏色帶來的誤差[17]，操作為：0.5ml 咖啡果皮提液樣液+甲醇溶液2.5ml+30%硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 試管中，30℃黑暗條件下反應(yīng)15min 后，在波長500nm 處測定吸光值A(chǔ)11，原花青素的吸光值為A=A1-A11，并根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算咖啡果皮中原花青素的含量[17]。

1.3.2 咖啡果原花青素提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 咖啡果皮中原花青素提取率的單因素試驗(yàn)

在20ml 試管中取0.2g 咖啡皮樣品粉末，加入一定體積的提取溶劑，在一定溫度水浴中提取一定時(shí)間，過濾，用提取溶劑定容于50ml 容量瓶中，取0.5ml 樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作方法操作，測量光吸收值并計(jì)算提取率。研究了不同提取劑及其濃度、固液比、提取時(shí)間、提取溫度和酸堿度對咖啡果皮中原花青素提取率的影響[17-18]。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在進(jìn)行了單因素對咖啡果皮中原花青提取率影響實(shí)驗(yàn)并分析了結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取四個(gè)對咖啡果皮原花青素提取率影響最大的自變量。根據(jù)Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，采用四因素（取提取劑濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比）三水平的響應(yīng)曲面分析法[19]，每組重復(fù)3 次，以咖啡果皮中原花青素的提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法分析法優(yōu)化咖啡果皮中原花青素的提取條件，使用Design-expert10 軟件進(jìn)行回歸分析。設(shè)計(jì)如下：

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因子設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下咖啡果皮原材料原花青素的提取率

從圖1 的可得，在20ml 試管中加入0.2g 不同處理（鮮果和干果）的咖啡果皮樣品，其他提取條件（即提取溶劑：選用1：70 的80%乙醇溶液，在70℃水浴鍋中提取50min）相同，各個(gè)成熟度都不超過3.5mg/g，干燥研磨后咖啡果皮中原花青素含量明顯增高到21.5mg/g，鮮果和干果各個(gè)成熟度差異顯著。因此，選擇干燥的咖啡果皮粉末作為原材料。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 不同提取溶劑及濃度對咖啡果皮原花青素提取率的影響

由圖2 分析可得，料液比為1∶50（g/ml），在70℃水浴中提取50min，分別加入不同濃度(40%～100%)的乙醇、甲醇和蒸餾水浸提，提取液濃度為40%，70%～100%時(shí)，甲醇比乙醇提取率高，但提取液濃度在50%～70%時(shí)乙醇提取率高，且在70%處達(dá)到峰值，提取率最高，水的提取率明顯比甲醇和乙醇的低，可能是原花青素非極性部分較大的原因。

2.2.2 料液比不同對咖啡果皮原花青素提取率的影響

由圖3 分析可得，加入提取劑70%乙醇溶液按不同料液比（1：20～1：100 單位：g/ml），在70℃水浴鍋中提取50min，咖啡果皮中原花青素提取率隨著提取溶劑的增加而顯著增加當(dāng)料液比在1：20～1：60范圍內(nèi)，由于提取液體積的增加和原花青素氧化速率的加快，導(dǎo)致原花青素提取速率的降低[19]，所以咖啡過果皮中原花青素的提取率在1：60 時(shí)有最大提取率，然后隨料液比的增大而逐漸降低。

2.2.3 提取溫度不同對咖啡果皮原花青素提取率的影響

由上圖4 分析可得，加入70%乙醇溶液，按固液比例為1∶60(g/ml)，分別按不同溫度(40℃～100℃)的水浴鍋中提取50min，提取溫度在40℃～90℃范圍內(nèi)，當(dāng)溫度增高時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取率隨著增加。在90℃時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取率最大，隨著溫度的進(jìn)一步升高時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取率下降。

2.2.4 提取時(shí)間不同對咖啡果皮原花青素提取率的影響

由圖5 分析可得，加入濃度為70%的乙醇溶液提取劑，比例為1：60(g/ml)，在90℃下水浴鍋中分別提取不同時(shí)間（30～90min）后，咖啡果皮中原花青素的提取率最大時(shí)提取時(shí)間為40min 時(shí)，，而后開始下降。這可能是由于提取時(shí)間較短時(shí)，咖啡果皮中原花青素來不及溶出[20]，時(shí)間過長咖啡果皮中原花青素又因?yàn)樘崛r(shí)間過長部分結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，雜質(zhì)成分也隨之增加[21]。

2.2.5 pH 不同對咖啡果皮原花青素提取率的影響

從圖6 可得，加入70%乙醇溶液(PH6)，比例為1：60(g/ml)，用0.1mol/L 硫酸調(diào)節(jié)pH（2～5），用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH（7～12），90℃水浴鍋中提取40min，在pH 為2～6(不加酸與堿時(shí)，pH 為6），原花青素提取率在pH 為6 時(shí)最大，隨后，隨pH 的增大而減小，可能是由于原花青素在氫氧化鈉的作用下，結(jié)構(gòu)遭到破壞。pH 過低或過高都不利于原花青素的提取，pH 過低時(shí)可能導(dǎo)致原花青素在提取過程中水解,所以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)不考慮pH 這個(gè)因素。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析

2.3.1 模型的建立與顯著性分析

在進(jìn)行了咖啡果皮中原花青提取的單因素實(shí)驗(yàn)的并進(jìn)行分析后的基礎(chǔ)上，選取對原花青素提取量有較為明顯影響的四個(gè)因子即提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間，以咖啡果皮原花青素提取率為響應(yīng)值，再進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

7 1 -1 0 0 22.62 23.01 8 0 0 0 0 25.41 23.30 9 0 -1 1 0 21.51 22.27 10 1 1 0 0 25.15 25.10 11 0 1 0 -1 15.08 22.22 12 -1 0 -1 0 15.54 18.07 13 0 0 0 0 21.51 23.30 14 -1 -1 0 0 24.11 23.30 15 0 1 -1 0 16.97 16.27 16 1 0 0 1 12.68 22.43 17 0 0 1 -1 23.27 23.09 18 1 0 0 -1 27.88 26.45 19 0 0 -1 1 21.38 16.41 20 -1 0 0 1 19.95 22.88 21 -1 1 0 0 24.76 20.12 22 0 -1 -1 0 20.67 20.00 23 1 0 -1 0 16.97 17.43 24 0 0 -1 -1 20.67 20.62 25 0 1 0 1 25.02 24.53 26 -1 0 0 -1 22.68 21.31 27 0 0 0 0 25.28 23.30 28 0 0 0 0 22.68 23.30 29 0 -1 0 1 22.49 21.54

對上表中數(shù)據(jù)根據(jù)軟件Design-Expert 10.0 進(jìn)行多元回歸擬合，得到目標(biāo)函數(shù)為咖啡果皮中原花青素提取量的回歸方程：

乙醇濃度、固液比、提取溫度、提取時(shí)間在設(shè)計(jì)中均經(jīng)量綱1 線性編碼處理,因此,方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標(biāo)值的影響程度,系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向[20]。

表3 方差分析

由表2 中方差分析可得，在該咖啡果皮中原花青素提取的數(shù)學(xué)模型中值為0.0015，小于0.01,所以該方程的模型達(dá)到了高度顯著的水平，且在失擬試驗(yàn)中，由數(shù)據(jù)可知其結(jié)果表現(xiàn)為不顯著，此時(shí)值為0.7499，表明未知因素對測試結(jié)果影響不大。在該回歸模型模型中其擬合度比較好，因?yàn)槠淇倹Q定系數(shù)R2=0.8465，超過84%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性可用此模型圖解釋，并且決定調(diào)整系數(shù)R2adj=0.6931 說明該模型可以較好地預(yù)測新數(shù)據(jù)。

表4 顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知：（1）在乙醇濃度、提取溫度、固液比和時(shí)間4 個(gè)因子中，提取溫度和提取劑濃度對咖啡果皮中原花青素的提取率有極顯著影響，其余各項(xiàng)對咖啡果皮中原花青素的提取率表現(xiàn)為不顯著影響；（2）在交互項(xiàng)中固液比與提取時(shí)間的偏回歸系數(shù)極顯著，說明提取過程中提取時(shí)間與料液比的交互項(xiàng)對咖啡果皮中原花青素的提取率有顯著影響；其余交互項(xiàng)對咖啡果皮中原花青素的提取率表現(xiàn)為不顯著影響；（3）由于二次項(xiàng)系數(shù)中X32的偏回歸系數(shù)達(dá)高度顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)因素對咖啡果皮中原花青素提取率的影響并非是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)也都會(huì)對咖啡果皮中原花青素提取率有顯著影響[21-22]。

2.3.2 單因素交互項(xiàng)對原花青素提取率的影響

通過軟件繪制咖啡果皮原花青素提取率和自變量關(guān)系的等高線及其對應(yīng)響應(yīng)面圖，從中可以清晰的看出：等高線圖能夠體現(xiàn)最優(yōu)條件下各因子的取值以及各因子之間的交互作用，等高線圖越圓，這兩因素交互作用越不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[21，23]。

圖7 反應(yīng)了提取溫度C 和提取時(shí)間D 處于一定狀態(tài)過程中，當(dāng)料液比不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素提取率也隨著乙醇濃度增高而緩慢上升，但并不顯著；固定乙醇濃度，咖啡果皮中原花青素提取率隨著料液比的增大，其并沒有顯著地增加；說明兩因素交互不明顯。

通過圖8 分析可得，在此過程中，提取過程中溫度不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素提取率隨著乙醇濃度并沒有太明顯的變化；乙醇濃度固定不變時(shí)，隨著溫度的上升咖啡果皮中原花青素提取率隨之變化較小，說明乙醇濃度與提取溫度的交互作用對咖啡果皮中原花青素的提取率影響不大。

由圖9 的3D 圖可以看出，提取時(shí)間不變咖啡果皮中原花青素的提取率隨著乙醇濃度的變化并沒有顯著變化，說明乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對咖啡果皮中原花青素提取率影響不大。

圖10 反映了，當(dāng)乙醇濃度A 與提取時(shí)間D 在咖啡果皮中原花青素的提取過程中不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取中提取溫度C 與料液比B 的交互作用對其提取率的影響。咖啡果皮中原花青素提取中提取溫度不變時(shí)，隨著固液比的增大，咖啡果皮中原花青素的提取率變化不大；當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著溫度的上升咖啡果皮中原花青素提取率緩慢上升而后減?。粌梢蛩亟换ゲ伙@著。

圖11 反映了在咖啡果皮中原花青素的提取過程中當(dāng)乙醇濃度A 和提取溫度C 不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素提取中料液比B 和提取時(shí)間D 的交互作用對其提取率的影響。料液比在提取過程中不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素提取率隨著提取時(shí)間的延長而提高；提取過程中提取時(shí)間取一定值時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取率隨著固液比的增大而先減后增，兩因素交互作用明顯，從圖可得咖啡果皮中原花青素提取率在料液比11～13 之間有最大值。

圖12 反映了在咖啡果皮中原花青素提取過程中乙醇濃度A 和料液比B 處于一定狀態(tài)不變時(shí)，提取溫度C 和提取時(shí)間D 的交互作用對咖啡果皮中原花青素提取率的影響。由圖12 中的3D 圖中看出，提取時(shí)間取一定值不變時(shí)，隨著提取溫度的上升咖啡果皮中原花青素的提取率而先升后降；當(dāng)提取溫度不變時(shí)，咖啡果皮中原花青素的提取率隨著提取時(shí)間的延長并無明顯變化；兩因素交對咖啡果皮中原花青素的提取率交互作用不顯著。

3 結(jié)果

通過Design Expert10.0 軟件確定的咖啡果皮原花青素提取最優(yōu)提取工藝為：提取溶劑及其濃度為80%的乙醇，固液比為1：69.97，提取溫度及時(shí)間為100℃下提取50min，理論提取率為30.099mg/g。根據(jù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測得咖啡果皮原花青素提取率實(shí)際值為30.086mg/g, 通過計(jì)算可得咖啡果皮原花青素提取率理論值與實(shí)際值誤差僅為0.044%，該模型能夠較好的預(yù)測實(shí)際提取率，確定最佳提取工藝。