蛋白質(zhì)含量測定和SDS-PAGE指紋圖譜的建立在乳制品營養(yǎng)價值研判中的應(yīng)用

秦貝樂 鄒昀珊 徐卓楠

摘 要：隨著生活水平的提高，人們對乳制品的需求量越來越大。但普通消費者不了解其中營養(yǎng)蛋白的成分，無法區(qū)分不同乳制品的優(yōu)劣。本研究通過紫外分光光度法和考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，比較不同乳制品中蛋白質(zhì)含量，同時使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），分析和鑒定其中的血清血蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，研判不同乳制品中蛋白含量高低和種類多少，建立蛋白質(zhì)含量測定法和SDS-PAGE指紋圖譜，從而判斷乳制品營養(yǎng)價值。

關(guān)鍵詞：乳制品;蛋白質(zhì)濃度;蛋白質(zhì)種類;考馬斯亮藍;SDS-PAGE

1.背景

乳制品營養(yǎng)豐富，市場廣闊，受到各年齡段人們的歡迎，且人們對其營養(yǎng)成分及哪種乳制品最具營養(yǎng)價值感到好奇。本研究將從此現(xiàn)象出發(fā)，用科學(xué)方法（即用于蛋白質(zhì)含量測定的考馬斯亮藍法及紫外分光光度法和用于蛋白質(zhì)類型分析與鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳法）研判這六種乳制品的蛋白質(zhì)含量高低和種類多少，從而建立蛋白質(zhì)含量測定方法和SDS-PAGE指紋圖譜，來判斷乳制品營養(yǎng)價值，從而獲得乳制品的營養(yǎng)價值信息。

據(jù)調(diào)查顯示，現(xiàn)有研究僅使用一種方法（例如：直接電位法，甲醛滴定法等）進行研究，而該小組使用多種方法確定蛋白質(zhì)含量。以上方法易于理解，結(jié)果直觀，應(yīng)用價值高。其次，研究目的不同。此前研究僅關(guān)注確定乳制品蛋白質(zhì)含量的方法，而本研究從科學(xué)的角度出發(fā)選擇大量乳制品樣品進行研究。

根據(jù)日常生活中常見的乳制品類型進行抽樣調(diào)查[4]，定量研究市場上某品牌乳制品的中有機鮮牛乳，生牛乳，發(fā)酵乳（酸奶），鮮牛乳，脫脂鮮牛乳以及風(fēng)味發(fā)酵乳 （藍莓味酸奶）中蛋白質(zhì)含量，定性分析它們是否都含有血清血蛋白、酪蛋白（包含β-酪蛋白和α-酪蛋白）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。

2.方法

2.1考馬斯亮藍法

將考馬斯亮藍G-250與不同濃度蛋白溶液（0.1mg/ml，0.2mg/ml， 0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml）混合并加入比色杯3/4處。測吸光度并繪制蛋白質(zhì)濃度標準曲線。 重復(fù)測3次（樣品配置：將1-6號牛奶分別稀釋5倍、10倍和100倍），取各組平均值。

2.2 A280紫外可見分光光度法（UV-VIS法）

依次將10倍稀釋的乳制品溶液1-6添加到比色杯中，并用UV分光光度計測量吸光度（重復(fù)測3次，取平均值）。

2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE）

將分離凝膠添加到TEMED中，混合注入玻璃板間隙中，再添加正丁醇。聚合結(jié)束后，除去液體，用去離子水洗滌凝膠上部，剩余液體用吸收紙干燥。將5ml5%濃縮凝膠插入梳子后，室溫下垂直放置。當(dāng)聚合時，將添加緩沖液的樣品加熱縮聚后，用去離子水沖洗凝膠，放入電泳槽中?；旌?0μL溴酚藍分別稀釋10倍和100倍。將1-6組乳制品注入并電泳，直到染料到達分離凝膠的底部。使用溶于乙醇，濃度為0.1%（W/V）的考馬斯亮藍R-250對瓊脂進行染色和浸泡;加入10%（V/V）的乙醇和7.5%（V/V）的乙酸浸泡瓊脂并反復(fù)洗滌以完成脫色。

3.1 標準曲線分析

考馬斯亮藍法測定A595nm處的吸光度并繪制標準曲線（如圖1），得出R2 = 0.9788的擬合曲線。測量280nm處的吸光度并繪制標準曲線（如圖2），得出R2 = 0.999的擬合曲線。0.9788和0.9999都接近1，因此可用于計算乳制品中的蛋白質(zhì)含量。

3.2 不同乳制品中的蛋白質(zhì)含量分析

如表1所示，將樣品分別稀釋5倍、10倍、100倍，在A595nm處測其吸光度，根據(jù)考馬斯亮藍法測的標準曲線算出每種乳制品的蛋白質(zhì)含量。#1有機鮮乳制品，#2生牛乳，#4鮮乳制品，#5脫脂鮮乳制品分別稀釋100倍，吸光度分別為0.585、0.935、0.515、0.205，#3發(fā)酵乳稀釋10倍后吸光度為0.634。計算可得各種類乳制品蛋白質(zhì)含量為：#1有機鮮乳制品10-20 mg/mL， #2 生牛乳大于100mg/mL; #3 發(fā)酵乳（酸奶）1-2 mg / mL; #4鮮乳制品10-20mg/mL。

如圖3所示，稀釋10倍的乳制品樣品在A280nm處進行測定。10倍稀釋后，#1，#2，#4和#5中測得的可溶性蛋白質(zhì)含量更高。從高到低稀釋10倍后，六種乳制品的蛋白質(zhì)含量從低到高分別為：脫脂鮮乳制品、鮮乳制品、有機鮮乳制品和生牛乳。

3.3不同乳制品中蛋白質(zhì)種類的分析

從圖4中六種類型乳制品的SDS-PAGE分析和已知蛋白質(zhì)成分比較（表2）可看出，除了#6所有乳制品都包含相似量的β-酪蛋白和α -酪蛋白，但從表3中可看出，#1、#2和#4β-乳球蛋白和α-乳白蛋白含量更高。α-乳清蛋白含有人體必需的大量氨基酸，例如人體必需卻不能人體合成的亮氨酸和異亮氨酸。盡管所有含蛋白質(zhì)的食物都含有這些，但可以看出新鮮的乳制品含量更加豐富。

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4.結(jié)論

六種乳制品中蛋白質(zhì)含量最高的是#2生牛乳，其濃度超過100 mg / mL，其次是#5脫脂鮮乳制品，然后是#4鮮乳制品和#1有機鮮乳制品。#1有機鮮乳制品蛋白質(zhì)種類最豐富（包括血清蛋白，酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白），其次是#2生牛乳和#4鮮乳制品。最后是兩種風(fēng)味的#3和#6發(fā)酵乳（幾乎不含蛋白質(zhì)）。