基于性質(zhì)分析建立HBc-VLP的高效純化技術(shù)

仲為錚 吳官梓 于貝禾

HBc-VLP由于其自身結(jié)構(gòu)與免疫原性的顯著優(yōu)勢(shì)而被廣泛研究，具有很大的應(yīng)用前景，規(guī)模化制備技術(shù)卻一直是阻礙其發(fā)展和應(yīng)用的瓶頸。常用的密度梯度離心由于處理量、時(shí)間長(zhǎng)、成本高等只能用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究，而基于色譜技術(shù)的純化方法只有少數(shù)形成了完整的工藝，但收率低。同時(shí)，色譜技術(shù)主要集中在離子交換層析的研究，但是，大腸桿菌表達(dá)體系中，許多宿主蛋白和HBc-VLP與離子交換填料具有比較相近的親和力，會(huì)在一定程度上影響離子層析的效率，且離子交換層析中蛋白與填料間相互作用力較強(qiáng)，容易導(dǎo)致目的蛋白難以洗脫甚至發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化而失去免疫原性。為了解決HBc-VLP現(xiàn)有純化工藝收率、純度等各方面存在的不足，本研究立足HBc-VLP的顆粒結(jié)構(gòu)與表面性質(zhì)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)HBc-VLP顆粒表面的突起區(qū)域含有較多的疏水性氨基酸，組成了一個(gè)個(gè)疏水性區(qū)域，賦予HBc-VLP表面較強(qiáng)的疏水性，因此發(fā)展了疏水層析為基礎(chǔ)的純化方法。

1. 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

用培養(yǎng)基將菌種活化，然后在培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落 ，之后進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)，最后蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

2.菌體的收集與破碎

將菌體離心收集后，進(jìn)行超聲菌體破碎，然后棄去細(xì)胞碎片等沉淀，保留上清。

3.疏水層析純化HBc-VLP

取10 mL Butyl-S介質(zhì)，裝柱，平衡緩沖液平衡十個(gè)柱體積。 60℃溫度處理30 min后的細(xì)菌破碎液上清30 mL，調(diào)節(jié)硫酸銨濃度為0.5 M，pH為7.0，上樣，用平衡緩沖液淋洗至基線走平并收集穿透組分。然后用不含硫酸銨的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫后收集。

4. 凝膠過(guò)濾層析精制HBc-VLP

疏水層析洗脫收集的15 mL洗脫液用100 kDa的超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，預(yù)裝柱預(yù)先用含0.15M NaCl 的20mM PB緩沖液平衡，將濃縮后的5 mL濃縮樣品上樣，分離后收集。

5.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

蛋白濃度檢測(cè)根據(jù) Bradford 的方法進(jìn)行測(cè)定：

取 100 μL 樣品加入到G-250工作液中測(cè)定 595 nm 處的吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可計(jì)算得到樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

6. 聚丙烯酰胺凝膠電泳

樣品與 5×的上樣緩沖液按照 4：1 的比例混合，100℃處理 5 min。 根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求取一定體積（< 30 μL）的處理后樣品用于電泳分析。

將處理后的樣品加入到電泳膠的樣品槽中。電泳儀初始電壓一般設(shè)置為90 V。 待樣品進(jìn)入分離膠，電壓可改為 120-160 V 運(yùn)行，直至標(biāo)示物溴酚藍(lán)遷移出電泳膠。 小心剝下電泳膠，準(zhǔn)備染色。

考馬斯亮藍(lán)染色液的配制：稱取1 g考馬斯亮藍(lán) R250 于450 mL的乙醇中，充分溶解。之后加入100 mL乙酸，攪拌混合，去離子水定容至1000 mL。

染色：將電泳后剝離的電泳膠放入染色液中，確保染色液充分覆蓋膠面。水平搖床上室溫下緩慢搖動(dòng)，直至充分染色。

染色液倒出后用去離子水清洗電泳膠。加入適量脫色液后，水平搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫脫色， 期間根據(jù)實(shí)際情況更換脫色液。當(dāng)電泳膠藍(lán)色背景基本脫除，蛋白條帶清晰即可停止脫色。更換電泳膠至去離子水中進(jìn)行圖像采集，或更換至含甘油的保存液保存。

7.高效液相色譜分析

高效液相色譜分析使用 Agilent 1100系統(tǒng)。 TSK G5000 PWXL色譜柱。流動(dòng)相為50 mM磷酸緩沖液。進(jìn)樣體積為 100 μL，流速設(shè)定0.5 mL/min，UV 檢測(cè)器的設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為 260 nm 和280 nm。

8.透射電鏡分析

密度梯度離心法純化得到的HBc-VLP及衍生物的顆粒形貌由FEI Tecnai 20透射電子顯微鏡檢測(cè)。在400目銅網(wǎng)上滴加少量樣品后1%乙酸雙氧鈾染色，水洗脫鹽干燥后觀測(cè)即可。

9.最后得出結(jié)論

此次研究的創(chuàng)新點(diǎn)便在操作過(guò)程中，我們打破了傳統(tǒng)的高速離心方法，采用光譜技術(shù)。光譜技術(shù)操作簡(jiǎn)單，易于蛋白質(zhì)活性，保持應(yīng)用范圍廣，分離效率高。這不僅僅是簡(jiǎn)單的創(chuàng)新，更是科技技術(shù)上的偉大創(chuàng)造。

通過(guò)這次科學(xué)實(shí)踐，我們學(xué)到了細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)踐操作，蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)的離心濃縮，蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)技術(shù)，蛋白質(zhì)純度的檢測(cè)技術(shù)等。