血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌臨床診斷的價(jià)值研究

楊葳 莊嚴(yán) 劉鵬飛

1 天津市醫(yī)療器械審評(píng)查驗(yàn)中心300191；2天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心300060；3天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科300120

0 引 言

結(jié)直腸癌是全球癌癥相關(guān)發(fā)病和死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在男性和女性常見(jiàn)癌癥中分別居第3位和第2位[1-2]。由于結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期。采取有效的早期篩查措施可在早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，從而進(jìn)行早期干預(yù)，提高患者的生存率。目前臨床上主要采用結(jié)腸鏡檢查和糞便潛血試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)直腸癌篩查[3-4]，但這兩種常規(guī)方法在實(shí)用性和靈敏度方面仍有缺陷：結(jié)腸鏡檢查可能帶來(lái)一系列的并發(fā)癥，如腸活檢部位出血、腸穿孔和感染等[5-6]；而糞便潛血試驗(yàn)易受飲食、藥物和其他因素的影響[3-4]。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、靈敏度及特異性高的結(jié)直腸癌篩查方法，在提高其篩查率的同時(shí)減輕患者痛苦。

遺傳和表觀(guān)遺傳的改變可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，這些異常改變的積累可通過(guò)激活腫瘤癌基因或滅活腫瘤抑癌基因促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[7]。甲基化是基因表觀(guān)修飾方式之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[8]。研究結(jié)果表明，基因異常甲基化與癌癥的發(fā)生相關(guān)，可作為分子標(biāo)志物進(jìn)行癌癥早期篩查[9]。近年來(lái)，基因甲基化檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于癌癥的早期診斷中。例如，胞裂蛋白9（sepint 9,SEPT9）基因甲基化已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為結(jié)直腸癌篩查的標(biāo)志物[10-11]。由于癌癥患者外周血中存在較高水平的循環(huán)游離DNA（circulatingfree DNA,cfDNA），因此提取血液中的cfDNA檢測(cè)基因甲基化水平為結(jié)直腸癌的早期篩查提供了新的可能。鑒于SEPT9、干擾素調(diào)節(jié)因子 4（interferon regulatory factor 4,IRF4）、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1（branched-chain amino acid transaminase 1,BCAT1）以及Ikaros家族鋅指蛋白 1（Ikaros family zinc finger 1,IKZF1）與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，故本研究提取結(jié)直腸癌患者血液中的cfDNA，檢測(cè)其中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因的甲基化水平，并分析其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，以期揭示基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年2月至2018年5月于天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤科接受手術(shù)治療的105例結(jié)直腸癌患者作為病例組，其中女性51例，男性50例，未記錄性別4例，年齡范圍20～76歲。同時(shí)選取年齡范圍和性別比例與病例組相近的105例健康體檢者作為對(duì)照組，另選取90例結(jié)直腸癌患者作為驗(yàn)證組。結(jié)直腸癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)家族性大腸息肉病史；經(jīng)影像學(xué)及病理檢查確診為結(jié)直腸癌。健康體檢者納入標(biāo)準(zhǔn)：腸鏡下除痔瘡?fù)?，無(wú)其他異常者。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

血清/血漿核酸純化試劑盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國(guó)Qiagen公司），血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit[天根生化科技（北京）有限公司]，DNA甲基化試劑盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit（美國(guó) Zymo Research公司）。

VS-TP24快速組織細(xì)胞破碎儀（無(wú)錫沃信儀器制造有限公司），T100 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），LX-200迷你離心機(jī)、QL-901旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司），5424R臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），DYCP-32B電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2.2 血液樣本DNA提取

使用乙二胺四乙酸二鈉抗凝真空采血管收集病例組和對(duì)照組受試者的外周血樣本，3 000×g離心5 min，得到血漿樣本。每份樣本取4～5 ml，嚴(yán)格按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取cfDNA，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 組織樣本DNA提取

收集驗(yàn)證組患者手術(shù)切除的癌組織（90例）和癌旁組織（90例），使用快速組織細(xì)胞破碎儀將其打碎處理為細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心3 min（離心半徑8.4 cm）后去上清；加入200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮；按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 甲基化特異性PCR檢測(cè)

嚴(yán)格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾；分別設(shè)計(jì)SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因的引物和探針（表1），擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系為：Taq酶 0.2μl，緩沖液 5μl，脫氧核糖核苷三磷酸 4μl，正向引物 2.5 μl，反向引物 2.5 μl，探針 0.5 μl，DNA模板5μl，加無(wú)核酸酶水至總體積50μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判斷甲基化狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和 IKZF1基因甲基化狀態(tài)

由表 2可知，病例組血液中 SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因甲基化陽(yáng)性率分別為67%（70/105）、44%（46/105）、45%（47/105） 和 46%（48/105），均高于對(duì)照組（均為0），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。聯(lián)合基因甲基化檢測(cè)以其中任一基因甲基化陽(yáng)性即判定為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，病例組血液中 SEPT9＋I(xiàn)RF4、BCAT1＋I(xiàn)KZF1 和 SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率分別為 68%（71/105）、60%（63/105） 和 76%（80/105），均高于對(duì)照組（均為0），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

2.2 結(jié)直腸癌患者血液中 SEPT9、IRF4、BCAT1、IKZF1基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

由表3可知，結(jié)直腸癌患者血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因甲基化狀態(tài)均與結(jié)直腸癌患者的腫瘤臨床分期、腫瘤最大徑、無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）和總生存期相關(guān)（均P＜0.05）；IRF4基因甲基化還與微衛(wèi)星狀態(tài)和病理部位相關(guān)（均P＜0.05）；IKZF1基因甲基化亦與微衛(wèi)星狀態(tài)相關(guān)（P＜0.05）。

由表4可知，結(jié)直腸癌患者血液中SEPT9＋I(xiàn)RF4、BCAT1＋I(xiàn)KZF1 和 SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1 聯(lián)合基因甲基化狀態(tài)均與結(jié)直腸癌患者的腫瘤臨床分期、腫瘤最大徑、PFS和總生存期相關(guān)（均P＜0.05）；BCAT1＋I(xiàn)KZF1聯(lián)合基因甲基化還與病理部位和分化程度相關(guān)（均P＜0.05）。

表1 甲基化特異性PCR相關(guān)基因的引物序列和探針

表2 各組血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因及聯(lián)合基因甲基化檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

表3 結(jié)直腸癌患者血液中SEPT9、IRF4、BCAT1、IKZF1單基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌患者癌組織中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因甲基化狀態(tài)

以結(jié)直腸癌患者癌組織為驗(yàn)證樣本，檢測(cè)其中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因的甲基化狀態(tài)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，癌組織中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因甲基化陽(yáng)性率分別為83%（75/90）、83%（75/90）、72%（65/90）和 61%（55/90），均高于癌旁組織中對(duì)應(yīng)的單基因甲基化陽(yáng)性率[9%（8/90）、9%（8/90）、13%（12/90）和 6%（5/90）]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；癌組織中 SEPT9＋I(xiàn)RF4、SEPT9＋BCAT1、IRF4＋BCAT1、SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1、SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率分別為94%（85/90）、94%（85/90）、92%（83/90）、98%（88/90）和99%（89/90），均高于癌旁組織中對(duì)應(yīng)的聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率 [10%（9/90）、17%（15/90）、17%（15/90）、18%（16/90）和 21%（19/90）]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

表4 結(jié)直腸癌患者血液中SEPT9、IRF4、BCAT1、IKZF1聯(lián)合基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論與結(jié)論

基因的異常甲基化是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。SEPT9是高度保守的三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白septin家族的成員之一，廣泛存在于人體細(xì)胞中[12]。相關(guān)研究結(jié)果表明，SEPT9基因甲基化檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌篩查的靈敏度為48%，具有良好的臨床指導(dǎo)意義[13]，且SEPT9基因甲基化陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌分期相關(guān)[14]。IKZF1在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、造血干細(xì)胞的增殖和分化等生物進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。BCAT1是一種代謝調(diào)節(jié)劑，其作用是催化支鏈氨基酸降解的第一步，并促進(jìn)谷氨酸的產(chǎn)生[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，IKZF1和BCAT1失調(diào)與多種癌癥相關(guān)，如鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌和結(jié)直腸癌[17]。Jedi等[18]發(fā)現(xiàn)，IKZF1和BCAT1在結(jié)直腸癌的各階段均高度甲基化，但在鄰近的非腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化。IRF4啟動(dòng)子CpG島基因特異性高甲基化也被證明與癌癥的進(jìn)展相關(guān)[19]。Luo等[20]指出，IRF4過(guò)甲基化與結(jié)直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)（比值比為16.96）相關(guān)。因此，本研究選擇了SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因，研究其單基因和聯(lián)合基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的價(jià)值。

表5 結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因及聯(lián)合基因甲基化檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

本研究結(jié)果顯示，血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1單基因甲基化陽(yáng)性率分別為67%、44%、45%和46%；而SEPT9＋I(xiàn)RF4、BCAT1＋I(xiàn)KZF1和SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率分別為68%、60%和76%，均高于對(duì)應(yīng)的單基因甲基化陽(yáng)性率。王秀江等[21]發(fā)現(xiàn)，APC、P16、DCC 和 MLH1 基因在結(jié)直腸癌組織中的甲基化陽(yáng)性率分別為52.0%、32.0%、44.0%和60.0%，而這4種基因聯(lián)合甲基化陽(yáng)性率為92.0%。何櫻等[22]的研究結(jié)果顯示，p16INK4a、MG-MT和RASSF1A單基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度分別為64%、61%和70%，而這3種基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為95.8%，表明聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高結(jié)直腸癌的診斷效能。本研究結(jié)果還顯示，SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1 聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率與PFS顯著相關(guān)，提示聯(lián)合檢測(cè)這4種基因甲基化有助于結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)，在臨床中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

組織活檢是結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，驗(yàn)證組癌組織樣本中 SEPT9＋I(xiàn)RF4＋BCAT1＋I(xiàn)KZF1聯(lián)合基因甲基化陽(yáng)性率為99%，高于病例組血液樣本的76%。但在結(jié)直腸癌早期篩查中，組織穿刺活檢存在取材困難、安全性有限、有創(chuàng)等缺點(diǎn)[23]，而血液檢測(cè)具有取樣方便、安全、無(wú)痛等優(yōu)點(diǎn)，且血液中的cfDNA可作為腫瘤檢測(cè)和預(yù)后監(jiān)測(cè)的特異性分子標(biāo)志物。由此可見(jiàn)，血液中SEPT9、IRF4、BCAT1和IKZF1基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其為結(jié)直腸癌的早期診斷提供了潛在生物標(biāo)志物，有望成為結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)診斷的一種新手段。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突