醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠生物安全性評價

程琳 李睿智 程鵬 祝君梅 李昕 李東風 于歡 王世煒 史夢柔陳斌 高萍

1天津市醫(yī)藥科學研究所300020；2愛美客技術發(fā)展股份有限公司，北京100022

0 引 言

在溫度、催化劑等條件引發(fā)下，自交聯(lián)凝膠原液可通過單體聚合、高分子交聯(lián)等途徑在原位上自行相變?yōu)閺椥阅z狀。自交聯(lián)凝膠臨床上已被用于關節(jié)腔、腹腔、骨、神經等外科手術，其可在腔隙中局部成型并附于創(chuàng)面，形成暫時的物理隔絕，預防局部組織粘連。同時還可抑制創(chuàng)口處的成纖維細胞聚集和新生血管形成，起到抑制瘢痕的效果[1]。常用的聚乳酸防粘連凝膠生物相容性良好，但其降解產物為酸性物質，影響抗炎性能[2-3]。相比于固體防粘連材料需額外與組織縫合固定、手術創(chuàng)傷較大[4]，自交聯(lián)透明質酸鈉凝膠潤滑性較好，適用于關節(jié)囊和婦科手術中預防組織粘連[5-6]，但其易從創(chuàng)面周圍的縫隙流出[7]，且降解過快，影響防粘連效果[8]。醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠具有給藥方便、創(chuàng)傷小、自黏附并緊密貼敷創(chuàng)面的優(yōu)勢，更利于創(chuàng)面與外界的物理隔絕，防粘連效果更佳[9]。

本研究采用的是市售的醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠，其植入體內成膠后固定性能好，降解期長，具有一定的抗炎性能和機械性能，有兼作醫(yī)用黏附劑的潛力，可通過局部填充占位和自身的抗粘連生物活性起到很好的抗粘連效果。已有研究者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，該產品可有效防止椎板切除術后瘢痕粘連形成，且對實驗動物無毒副作用[10]。

因醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠擬用于體內，且需長期存留，故對其生物安全性有嚴格要求，加之其構成較為復雜，生物相容性檢驗顯得尤為重要。本研究旨在通過鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗（Ames實驗）、體外染色體畸變實驗和體外基因突變實驗對醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠的遺傳毒性進行較為全面的檢測，并檢測其急性全身毒性、熱原性和溶血性，以驗證其生物安全性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠（批號20141008，愛美客技術發(fā)展股份有限公司），小鼠淋巴瘤細胞L5178Y、中國倉鼠肺成纖維細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌 TA97、TA98、TA100、TA102（天津市疾病預防控制中心），胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），1,8-二羥基蒽醌（美國Fluka公司），2-氨基芴、敵克松、6-巰基鳥嘌呤、7,12-二甲基苯蒽（美國Sigma公司），2，4-二硝基氯苯（天津市光復精細化工研究所），注射用絲裂霉素（批號100110，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），注射用環(huán)磷酰胺（批號10110621，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），甲基磺酸乙酯（上海試劑一廠），氯化鈉注射液（批號9J93B，中國大冢制藥有限公司）。肝微粒體酶（S9）液由筆者采用苯巴比妥和β-萘黃酮聯(lián)合誘導大鼠獲得，其蛋白含量和活力經測定均符合要求，實驗時將S9液與6-磷酸葡萄糖、氧化性輔酶Ⅱ、KCl等輔助因子配制成S9混合液。

健康無特定病原體級雄性昆明種小鼠20只，5～6周齡，體質量范圍19.6～22.5 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物實驗中心，許可證號為SCXK（軍）2009-003。健康普通級雄性日本大耳白兔5只，3月齡，體質量范圍2.1～2.6 kg，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，許可證號為SCX K（京）2011-0003。

HERAcellTM150i CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），SW-CJ-2F超凈工作臺（上海善志儀器設備有限公司），Microphot-FXA倒置顯微鏡（日本Nikon公司），T200電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），CL-32L高壓滅菌器（日本ALP公司），ZRY-2D智能熱原儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司），T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 凝膠浸提液的制備

醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠按照專利配制[11]，羧甲基葡糖胺聚糖膠體液和戊二醛溶液分別裝載于雙聯(lián)注射裝置的A管和B管中，推針注射時，這兩種液體在共同針頭處自動混合反應，快速形成凝膠。推針時A、B管均推棄初始的0.5 ml，余下的2.0 ml被推注于無菌容器中（共推注4.0 ml），靜置30 min待凝膠凝固后，按不同的浸提比例向凝固凝膠中加入不同的浸提介質制備浸提液。其中Ames實驗是按浸提比例0.2 g/ml分別加入氯化鈉注射液和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于 37℃振蕩培養(yǎng)箱中浸提72 h；急性全身毒性實驗和熱原實驗均按浸提比例0.2 g/ml加入氯化鈉注射液，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中浸提72 h；體外染色體畸變實驗和體外基因突變實驗均按浸提比例0.2 g/ml加入空白培養(yǎng)基，于37℃CO2培養(yǎng)箱中浸提72 h；溶血實驗則按浸提比例0.5 g/ml加入氯化鈉注射液，于37℃水浴中浸提30 min。

1.2.2 遺傳毒性實驗

結合圖9、圖10可以得到，方鉛礦具有較好浮選回收率的礦漿電位區(qū)間與元素硫存在的電位-pH區(qū)間大致重合，這是因為在此區(qū)間內生成的元素硫具有良好的疏水性，從而提高了方鉛礦浮選回收率。當?shù)V漿電位過低時，溶液具有強還原性，此時硫元素會被還原成親水性的兩性離子HS-，使礦物疏水性減弱，回收率降低。當?shù)V漿電位過高時，溶液呈強氧化性，會生成PbO，形成親水鈍化層[8]，同樣會影響方鉛礦浮選，使回收率降低。

1.2.2.1 Ames實驗

采用平板滲入法進行Ames實驗，在活化（＋S9）和非活化（-S9）條件下，TA97、TA98、TA100、TA102菌株均設凝膠鹽水浸提液組、凝膠DMSO浸提液組、鹽水對照組（氯化鈉注射液）、DMSO對照組和陽性對照組。陽性對照組設2個平行培養(yǎng)皿，其余每組設3個平行培養(yǎng)皿。其中活化條件下陽性對照為2-氨基芴（200μg/皿），非活化條件下陽性對照為敵克松（50 μg/皿，TA97、TA98、TA100）和 1，8-二羥基蒽醌（50 μg/皿，TA102）。將 0.1 ml受試菌液、0.1 ml浸提液或對照液與2 ml溫頂層瓊脂液混合，快速倒入已鋪好底層瓊脂的平皿中，凝固后反轉平皿，于37℃條件下培養(yǎng)72 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

1.2.2.2 體外染色體畸變實驗

在活化（＋S9）和非活化（-S9）條件下，均設陰性對照組（空白培養(yǎng)基）、陽性對照組和3個劑量組（凝膠培養(yǎng)基浸提液組和1/2、1/4凝膠培養(yǎng)基浸提液組）。活化條件下陽性對照為環(huán)磷酰胺（終質量濃度為20μg/ml），非活化條件下陽性對照為絲裂霉素（終質量濃度為0.25μg/ml）。將中國倉鼠肺成纖維細胞傳代培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，活化各組加入浸提液或對照液作用6 h，非活化各組加入浸提液或對照液作用24和48 h?；罨鹘M作用結束后吸棄培養(yǎng)液，洗滌細胞，加入新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，收獲細胞；非活化各組作用結束后收獲細胞。各組均于收獲細胞前4 h加入秋水仙素（終質量濃度為10μg/ml）使細胞停止在中期分裂相。對收獲的細胞進行離心、低滲、固定、制片和姬姆薩（Giemsa）染色，光學顯微鏡下各組選擇100個分散良好的中期分裂相進行染色體畸變分析，統(tǒng)計畸變細胞數(shù)。

1.2.2.3 體外基因突變實驗

在活化（＋S9）和非活化（-S9）條件下，均設陰性對照組（空白培養(yǎng)基）、陽性對照組和3個劑量組（凝膠培養(yǎng)基浸提液組和1/2、1/4凝膠培養(yǎng)基浸提液組）?；罨瘲l件下陽性對照為甲基磺酸乙酯（終質量濃度為10μg/ml），非活化條件下陽性對照為7，12-二甲基苯蒽（終質量濃度為25μg/ml）。將L5178Y細胞傳代培養(yǎng)24 h，消化、計數(shù)調整細胞濃度為5×105個/ml；活化各組加入浸提液或對照液于50 ml離心管中37℃、70～80 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，非活化各組同條件下振蕩培養(yǎng)24 h；離心，棄上清，重懸后調整細胞濃度為2×105個/ml；當天取適量細胞懸液，梯度稀釋后接種于96孔板中（1.6個/孔），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)，計算第0天的平板接種效率（PE0）；將上述所得細胞懸液作2 d表達培養(yǎng)，結束后取適量表達后的細胞懸液，梯度稀釋并接種于96孔板中，培養(yǎng)12 d后計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)，計算第2天的平板接種效率（PE2）及細胞相對存活率（relative survival,RS）。取適量2 d表達培養(yǎng)后的細胞懸液，調整細胞濃度后（1×104個/ml）加入三氟胸苷，混勻，接種于96孔板中（2 000個/孔），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)，突變集落按大、小集落分別計數(shù)，再計算大集落突變頻率（large colony mutation frequency,L-MF）、小集落突變頻率（small colony mutation frequency,S-MF）、總突變頻率（total mutationfrequency,T-MF）和小集落突變百分率（percentage of small colony mutants,SCM）。

1.2.3 熱原實驗

日本大耳白兔于普通級動物室中單籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對濕度40%～70%，光照節(jié)律為12 h光照/12 h黑暗，自由進食飲水。采用自動熱原儀對通過體溫初篩的大耳白兔進行肛溫測量，每隔0.5 h測量1次，一般測2次，兩次體溫之差≤0.2℃即符合要求，以這兩次體溫的均值作為該兔的正常體溫。在測定正常體溫后15 min內，自兔耳緣靜脈緩緩注入38℃預熱的凝膠鹽水浸提液（10 ml/kg）。注射后每隔0.5 h用自動熱原儀測量兔體溫1次，共測6次，以6次體溫中的最高體溫減去正常體溫即為該兔體溫的升溫值。

1.2.4 急性全身毒性實驗

1.2.5 溶血實驗

采用直接接觸法檢測醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠的溶血性能，設樣品組、陰性對照組和陽性對照組，每組3個50 ml錐形瓶；樣品組每瓶中放入醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠5.0 g，再加入10 ml氯化鈉注射液；陰性對照組每瓶中加入10 ml氯化鈉注射液；陽性對照組每瓶中加入10 ml蒸餾水；將上述錐形瓶37℃水浴30 min；每瓶加入0.2 ml稀釋后的抗凝兔血，輕輕搖勻，繼續(xù)37℃水浴60 min；將各瓶中的液體分別轉入離心管中，800×g離心5 min，取上清，采用分光光度計在545 nm波長處測定上清的吸光度值，計算樣品的溶血率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，計數(shù)資料采用百分比表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，體外細胞基因突變實驗數(shù)據(jù)比較采用Z檢驗，急性全身毒性實驗數(shù)據(jù)比較采用重復測量資料方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Ames實驗

Ames實驗結果見表1，在活化和非活化條件下，陽性對照組4種菌株的回變菌落數(shù)均超出陰性對照組的3倍；凝膠鹽水浸提液組和凝膠DMSO浸提液組與相應的陰性對照組比較，4種菌株的回變菌落數(shù)均未達到后者的2倍，表明醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠對組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102無致突變性。

2.2 體外染色體畸變實驗

由表2可知，非活化條件下陽性對照組細胞的染色體畸變率為17%（24 h）和19%（48 h），活化條件下陽性對照組細胞的染色體畸變率為16%（24 h），分別高于同條件下的陰性對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；在非活化條件和活化條件下，3個劑量組（凝膠培養(yǎng)基浸提液組和1/2、1/4凝膠培養(yǎng)基浸提液組）細胞的染色體畸變率均為0，各劑量組間無量效關系，表明醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠無誘發(fā)中國倉鼠肺成纖維細胞染色體畸變的作用。

表1 醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠對組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌回變菌落數(shù)的影響（個/皿，Mean±SD）

2.3 體外細胞基因突變實驗

由表3可知，在活化和非活化條件下，陰性對照組的PE0、PE2、T-MF和SCM均在規(guī)定范圍內；陽性對照組的T-MF均達到陰性對照組的2倍以上；3個劑量組（凝膠培養(yǎng)基浸提液組和1/2、1/4凝膠培養(yǎng)基浸提液組）誘發(fā)的L-MF、S-MF和T-MF均呈劑量依賴性增長，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.4 熱原實驗

由表4可知，注射凝膠鹽水浸提液后，3只日本大耳白兔的體溫升溫值均＜0.6℃，體溫升溫值總和＜1.3℃，未見凝膠有熱原反應。

2.5 急性全身毒性實驗

急性全身毒性實驗結果顯示，分別經靜脈注射和腹腔注射凝膠鹽水浸提液和氯化鈉注射液（對照）后 4、24、48和 72 h，各組小鼠均無死亡，小鼠活動及精神狀態(tài)良好，大小便正常，肉眼未見任何毒性反應癥狀；且由表5可知，隨著注射后時間的延長，樣品組（靜脈注射、腹腔注射）與對應的對照組（靜脈注射、腹腔注射）小鼠體質量均有所增長，但兩組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表2 醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠作用不同時間對體外中國倉鼠肺成纖維細胞染色體畸變率的影響

表4 耳緣靜脈注射羧甲基葡糖胺聚糖凝膠鹽水浸提液后不同時間3只日本大耳白兔的體溫變化

表5 注射后不同時間各組小鼠的體質量變化（g，Mean±SD）

2.6 溶血實驗

溶血實驗結果顯示，陰性對照組、陽性對照組和樣品組的平均吸光度值分別為0.002、0.834和0.003，計算得到醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠的溶血率為0.1%，表明該凝膠無溶血作用。

3 討論與結論

羧甲基葡糖胺聚糖凝膠是一種新型醫(yī)用抗粘連材料，其配方新穎，成分較多，使用時反應相對復雜，且預期要在體內長期存留，尤其是用于神經外科時，血腦屏障完整性受損，對檢品的生物安全性要求更為嚴苛。本研究依據(jù)國家標準，同時考慮到醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠產品的自身特點和預期臨床應用，選擇了相應的體內外安全性實驗對產品的生物相容性進行了較為全面的檢測。

遺傳毒性研究的目的是檢測受試物是否能引起遺傳物質損傷，從而導致細胞衰老、突變、癌變和遺傳性狀的改變，并評價其對人體的潛在致畸、致癌和致突變作用，是生物安全性評價的重要環(huán)節(jié)。經多年發(fā)展，遺傳毒性研究已形成了多種實驗體系，涉及的微核實驗、Ames實驗、DNA損傷實驗、體外基因突變實驗等各有優(yōu)劣。研究結果表明，受試物在一種遺傳毒性實驗中可誘發(fā)某種基因突變,但在另一種遺傳毒性實驗中未必會誘發(fā)基因突變，若該受試物在多種遺傳毒性實驗中均能誘發(fā)基因突變,才表明其可能對人體有潛在的遺傳毒性作用。因此，依據(jù)國家標準，在安全性評價中需要將不同原理、覆蓋不同遺傳學終點的遺傳毒性實驗組合使用，以提高遺傳毒性實驗的準確性和效率。

本研究選擇Ames實驗、體外染色體畸變實驗和小鼠淋巴瘤細胞胸苷激酶基因突變實驗綜合評價醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠的遺傳毒性。其中Ames實驗可檢測不同類型的基因突變，如TA97、TA98菌株檢測移碼突變，TA100、TA102菌株檢測堿基置換和移碼突變，該實驗高效、經濟且靈敏[12-13]；體外染色體畸變實驗可檢測導致動物細胞染色體異常的種類，包括染色體結構裂隙、斷裂、缺失、微小體及著絲粒環(huán)等諸多終點改變[14]；小鼠淋巴瘤細胞胸苷激酶基因突變實驗不僅可檢測點突變等小的基因突變，還可檢測染色體水平胸苷激酶基因位點的缺失、移位等大的遺傳突變[15]。本研究中上述3項實驗結果顯示，在活化和非活化條件下，陰性對照組和陽性對照組的檢測結果均有明顯差異，符合實驗成立條件；陰性對照組和凝膠浸提液組的檢測結果均無明顯差異，凝膠浸提液各劑量組的L-MF、S-MF和T-MF均未出現(xiàn)明顯升高，故可判定醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠不具有遺傳毒性。

細菌內毒素實驗和熱原實驗均能對醫(yī)療產品的熱原性進行檢測。其中細菌內毒素實驗是針對脂多糖這一類熱原性物質的特異性檢測，而熱原實驗的檢測譜廣，能檢測出包括細菌內毒素在內的多種生物和化學成分的熱原物質[16]，更適用于本研究中構成較為復雜的醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠產品的熱原性檢測。

急性全身毒性實驗是認識和研究藥物對機體毒性反應的第一步。本研究采用了腹腔注射和靜脈注射兩種給藥方式，全面研究了醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠的水溶性和脂溶性浸提物對全身毒性的影響，為進一步設計相關毒性實驗提供了依據(jù)。

受試物產生溶血的原因包括受試物材料表面機械損傷和材料可溶性殘余低分子化學作用兩方面。針對醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠構成較復雜的特點，本研究評價了凝膠材料殘余單體及低分子物質在體外環(huán)境下的急性溶血機能。結果顯示，陰、陽性對照均符合要求，樣品組溶血率僅為0.1%（溶血率＜5%即合格），可認為醫(yī)用羧甲基葡糖胺聚糖凝膠無體外溶血作用。

本研究將羧甲基葡糖胺聚糖膠體液和戊二醛溶液混合，短時間內凝集后，再進行浸提，評價其生物安全性。該自交聯(lián)凝膠的3項遺傳毒性實驗、急性全身毒性實驗、熱原實驗和溶血實驗的實驗結果均符合醫(yī)用生物材料的要求，這為該材料的預期臨床使用提供了依據(jù)，為排除可能的危害提供了科學依據(jù)，也為其他成分和反應較復雜的生物材料的安全性評價提供了思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突