CD4＋CXCR5＋T細胞及程序壞死因子在結核中的作用機制

孫海柏 馮冉冉 張東 王瀟 劉佳慶

天津市海河醫(yī)院檢驗科300350

0 引 言

結核?。╰uberculosis）是因人體感染結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）而引起的慢性傳染性疾病，是嚴重危害人類生命和健康的重要傳染病之一[2]。世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，中國每年死于結核病的人數(shù)多達十三萬[1]。由于實驗室檢驗結核病的低特異性，以及臨床治療時的隨訪指標匱乏，使研究者關注結核病致病的免疫學機制。結核分枝桿菌是一類胞內(nèi)寄生性細菌，其引起的主要免疫應答為細胞免疫[3]。結核分枝桿菌能夠誘導輔助性Th1細胞、Th2細胞移動并發(fā)揮作用，導致機體的免疫功能紊亂，進而引發(fā)程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配體（PD-L1）在結核病患者中高表達[4]，尤其是降低肺結核病患者的CD4+T細胞免疫功能[5]。

CD4+T細胞可以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)劑，如白細胞介素 12（interleukin-12，IL-12）、干擾素 γ（interferon gamma，IFN-γ）和淋巴毒素 α，CD8+T 細胞和 γδT 細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶，在Fas配體的依賴和非依賴機制下對結核菌和被感染的細胞產(chǎn)生直接效應。外周T細胞通過識別結核桿菌早期分泌蛋白和Mtb39等結核菌抗原，刺激IFN-γ和腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生[6]。濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cells，Tfh）是新型的CD4+T細胞的獨立亞群，可以表達C-X-C趨化因子受體5（C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5）、誘導性協(xié)同刺激因子（inducible costimulator，ICOS）、PD-1、B 細胞淋巴瘤（B-cell lymphoma 6，BCL-6）原癌基基因、IL-21 等細胞因子。Tfh細胞的主要功能是輔助B細胞產(chǎn)生抗體和輔助抗體類別轉(zhuǎn)換，促使高親和力B細胞分化為漿細胞或記憶細胞，從而促進體液免疫應答的過程[7]。Tfh細胞與多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系，其中CXCR5是Tfh細胞的特異性標志物，是Tfh遷移和定位的重要“轉(zhuǎn)運分子”，可募集Tfh與B細胞匯合并相互作用；ICOS與其受體ICOSL結合并相互作用，促進Tfh細胞的產(chǎn)生和生發(fā)中心的形成；PD-1是Tfh細胞高表達的抑制性因子受體，作為Tfh細胞的表面標志物之一提供抑制信號，抑制Tfh細胞增殖，防Tfh細胞的過度轉(zhuǎn)化，且協(xié)助B細胞向漿細胞轉(zhuǎn)換，在調(diào)節(jié)因微生物引起的感染性免疫中發(fā)揮重要作用。本研究中，將Tfh細胞和PD-1作為主要研究對象，分別觀察其在肺結核病不同階段的表達規(guī)律和變化趨勢，探討Tfh細胞、PD-1在肺結核中診斷和治療中的作用。本研究可以揭示Tfh細胞在肺結核病中的免疫學作用和臨床意義，同時為探索肺結核疾病的診斷和療效評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇天津市海河醫(yī)院2018年1月至2019年1月收治的肺結核病確診患者140例，其中男性85例，女性55例，年齡（42.2±18.2）歲。另外選擇在天津市海河醫(yī)院體檢中心進行胸片檢查的健康者140例，其中男 78例，女 62例，年齡（38.1±17.2）歲。肺結核病診斷標準為：根據(jù)《結核病診斷和治療指南》的標準，滿足以下任何一條，即可確診。痰查抗酸桿菌陽性2次；痰查抗酸桿菌陽性1次，同時結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性1次；痰查抗酸桿菌陽性1次，同時胸部X線攝片顯示肺結核征象。

入組標準：未經(jīng)抗結核治療或治療時間不滿1周者；嚴格遵守6個月短程治療方案2HREZ/4HR或2HREZ/4（HR）3，必要時改為9個月強化治療方案3HREZ/6HRE，且期間不得增加或改用其他抗結核藥者；無惡性腫瘤、糖尿病、塵肺、肝炎、嚴重心肝腎疾病、艾滋病等合并癥者；胸部影像學檢查無異常者；女性為非孕期、非哺乳期；自愿簽署知情同意書者。

排除標準：經(jīng)過抗結核治療超過1周者；治療期間增加或改用其他抗結核藥者；既往有塵肺、艾滋病、結核病、糖尿病、肝炎、嚴重心肝腎疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等病史者；使用免疫抑制劑和免疫增強劑的系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、類風濕病、風濕病、多發(fā)性硬化癥等免疫系統(tǒng)疾病患者；孕期、哺乳期女性患者；未簽署知情同意書或中途退出研究者。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

BB515（CD4）、AF647（CXCR5）、PerCP-Cy5．5（PD-1）熒光染色劑（美國BD公司）。BDFACSCanto II型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2.2 分組方法

140例肺結核患者均入肺結核組，140例健康者均入健康對照組；肺結核組與對照組性別、年齡的差異無統(tǒng)計學意義。所有肺結核組患者的治療方案均為世界衛(wèi)生組織推薦的6個月的利福平用藥2HREZ/4HR 或 2HREZ/4（HR）3短程治療方案；治療2個月末痰涂片結果未轉(zhuǎn)陰者，改為9個月的利福平用藥3HREZ/6HRE強化治療方案。根據(jù)經(jīng)過治療后轉(zhuǎn)歸情況，將肺結核組的140例患者，進一步分為痰涂片轉(zhuǎn)陰組（PTB-SN）120例；痰涂片未轉(zhuǎn)陰組（PTB-SP）20例。

1.2.3 標本采集

健康對照組和肺結核組中的所有受試者均于清晨空腹采集外周血4 ml，所有樣本均在采集后2 h內(nèi)進行處理和分析。外周血單個核細胞分離方法為：取乙二胺四乙酸（ethy lenediaminetetraacetate acid,EDT A）抗凝的新鮮外周靜脈血，離心，除去上層血漿；加入與除去的血漿等體積的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），混合均勻；取離心管，向管內(nèi)加入5 ml淋巴細胞分離液；用吸管吸取上述稀釋后的血液，沿離心管側壁小心緩慢地加到淋巴細胞分離液之上，使二者形成明顯的界面；離心后，可見離心管中的液體分為四層，由上至下依次為血漿和血小板層，單個核細胞層（呈白色霧狀）、淋巴細胞分離液層，多形核白細胞和紅細胞層；準備新的離心管，用移液器輕輕插入單個核細胞層，小心吸取液體后加入新管中；加入2 ml PBS充分混勻后離心，棄上清；再加入2 ml PBS洗液重懸細胞并混勻，離心棄上清，并重復一遍此步驟；洗滌3遍后，懸于1 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，充分混勻。從而制成用于流式細胞術檢測的單個核細胞懸液。

1.2.4 Tfh細胞和PD-1含量的測定

取3支流式上樣管，分別標記編號（1～3），在各流式管中加入100μl單個核細胞懸液；按照試劑說明書，向管1和管2中依次加入BB515（CD4）、AF647（CXCR5）、PerCP-Cy5.5（PD-1）熒光抗體，管 3 中不加任何抗體（空白對照）；各管內(nèi)液體混勻后避光孵育30 min；取出各管，離心去上清，重復洗2次后加PBS重懸；使用流式細胞儀檢測Tfh細胞和PD-1；用Diva軟件進行細胞組分分析，計算Tfh細胞、PD-1因子，以及其他相關細胞的含量或比例。比較肺結核組與健康對照組研究對象的Tfh細胞、PD-1的差異；比較痰涂片轉(zhuǎn)陰組和未轉(zhuǎn)陰組在治療周期中的差異。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（Mean±SD）表示；方差齊性檢驗后，采用t檢驗比較各組間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Tfh 細胞和CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞測定

肺結核組和健康對照組外周血單個核細胞中Tfh 細胞（CD4＋CXCR5＋T 細胞）、CD4＋CXCR5＋ICOS＋T細胞、CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞的檢測結果及分析策略圖，如圖1所示。圖1中，前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）反映細胞的大??；側向散射光（side scatter，SSC）反映細胞的復雜程度；A表示面積。

2.2 短程治療前后肺結核組與健康對照組Tfh細胞比較

利福平短程治療前、后，肺結核組與健康對照組的Tfh細胞比例比較，如圖2所示。治療前，肺結核組外周血單個核細胞中Tfh細胞/CD4＋T細胞比例為3.37%±0.45%，顯著高于健康對照組的2.22%±0.47%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。治療后，肺結核組外周血單個核細胞中Tfh細胞/CD4＋T細胞比例為2.39%±0.38%，與治療前（3.37%±0.45%）相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 短程治療前后肺結核組與健康對照組PD-1比較

利福平短程治療前、后，肺結核組與健康對照組的PD-1比較，如圖3所示。治療前，肺結核組患者 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞/Tfh 細胞比例為25.33%±10.08%，顯著高于健康對照組的8.42%±2.31%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。治療后，肺結核組患者的 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞/Tfh 細胞比例為11.35%±2.65%，顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.4 治療周期對Tfh細胞和PD-1的影響

對于肺結核組中的痰涂片轉(zhuǎn)陰和痰涂片未轉(zhuǎn)陰的2個亞組，其在治療周期中的Tfh細胞和PD-1變化分別如圖4和圖5所示。

如圖4所示，對于痰涂片轉(zhuǎn)陰組，與治療前相比，治療5個月和6個月后，其外周血中Tfh細胞比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05和P＜0.01）。對于痰涂片未轉(zhuǎn)陰組，與治療前相比，治療6個月后，其外周血中Tfh細胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在治療5個月和6個月后，痰涂片轉(zhuǎn)陰組的Tfh細胞比例明顯低于痰涂片未轉(zhuǎn)陰組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

結果表明，痰涂片轉(zhuǎn)陰組和痰涂片未轉(zhuǎn)陰組的外周血PD-1在治療過程中均呈緩慢下降趨勢。與治療前相比，痰涂片轉(zhuǎn)陰組在治療5個月和6個月后，以及痰涂片未轉(zhuǎn)陰組在治療后2個月、5個月和6 個月后，CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞/Tfh 細胞比例均有明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。在治療2個月、5個月和6個月后，與痰涂片未轉(zhuǎn)陰組相比，痰涂片轉(zhuǎn)陰組的CD4＋CXCR5＋PD-1＋T細胞/Tfh細胞比例明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖1 Tfh細胞流式細胞檢測及分析策略圖

圖2 肺結核組在利福平短程治療前、后與健康對照組Tfh細胞的比較

圖3 肺結核組在利福平短程治療前、后與健康對照組PD-1的比較

圖4 痰涂片轉(zhuǎn)陰組和痰涂片未轉(zhuǎn)陰組在治療周期中的Tfh細胞變化趨勢

3 討論與結論

有研究結果表明，Tfh細胞與某些疾病的發(fā)生相關[8-10]，Tfh細胞參與某些自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[11]、免疫缺陷病[12]、感染性疾病[13]、腫瘤[14]和移植排斥等。本研究結果表明，在肺結核病的發(fā)生過程中，有Tfh細胞的參與。肺結核病是由結核分枝桿菌感染人體引起的，感染過程中占主要地位的是細胞免疫反應，且以淋巴細胞介導為主。目前，肺結核診斷的最新標準包括：病理檢查、涂片查抗酸桿菌、痰培養(yǎng)、結核分枝桿菌熒光染色鏡檢等。其中，熒光染色鏡檢敏感性很好，但很多醫(yī)院沒有開展[15]。因此，本研究仍然采用傳統(tǒng)的診斷標準選取病例樣本。

本研究結果表明，與健康對照組和肺結核組治療后相比，肺結核組在治療前有更高的Tfh細胞比例，提示Tfh細胞可能與結核周期變化相關。在治療過程中，隨著痰涂片轉(zhuǎn)陰，Tfh細胞呈下降趨勢，且在治療后，外周血中的Tfh細胞比例恢復到和健康對照組相當?shù)乃剑崾綯fh細胞的變化趨勢可以反映肺結核病的治療效果，對結核病的診斷和療效評估有一定的指導意義。

PD-1通過PD-1/PD-L通路控制宿主的免疫防御[17]，其對患者體內(nèi)的T細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用是導致結核桿菌持續(xù)存在的原因之一，提示PD-1同樣參與了肺結核病的發(fā)生過程[16]。本文的研究結果表明，肺結核組患者在治療后，其PD-1比例均明顯降低，提示PD-1在肺結核病中同樣發(fā)揮重要的作用，而且與體內(nèi)Tfh細胞在結核周期中的反應呈正相關關系。在治療過程中，痰涂片轉(zhuǎn)陰組和痰涂片未轉(zhuǎn)陰組的PD-1均呈下降趨勢，且在不同的治療周期兩組間存在明顯差異。該結果提示，PD-1比例與肺結核患者體內(nèi)結核分枝桿菌的含量和患者體內(nèi)能否清除結核分枝桿菌有一定的關系[18]。本文結果為使用PD-1抑制劑進行結核病治療提供了理論依據(jù)，推測使用抗結核藥物聯(lián)合PD-1抑制劑將有助于結核病的治療。

圖5 痰涂片轉(zhuǎn)陰組和痰涂片未轉(zhuǎn)陰組在治療周期中的PD-1變化趨勢

本研究結果表明，肺結核組患者外周血單個核細胞中 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞/Tfh細胞比例顯著高于健康對照組受試者，提示PD-1參與了肺結核病的發(fā)生和發(fā)展。該結果與Bandaru等[19]和Jurado等[20]的研究結果一致。結核分枝桿菌感染時，體內(nèi)T淋巴細胞上的PD-1表達升高，且對于不同階段的肺結核病，其PD-1表達量有差異。此外，痰涂片轉(zhuǎn)陰組的 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 細胞比例在治療周期中呈下降趨勢。前期研究結果表明，肺結核患者外周血中PD-1表達升高，且PD-1的表達升高與肺結核患者細胞免疫功能下降相關[4]。研究結果證實，許多病原感染，包括病毒、細菌和原蟲等，其利用PD-1/PD-L通路削弱宿主的免疫防御能力，促使感染的病原持續(xù)存在[21]。而阻斷PD-1/PD-L通路可以顯著提高T淋巴細胞的抗結核能力，說明PD-1/PD-L通路與結核持續(xù)慢性感染息息相關。因此，PD-1在肺結核病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，本研究結果表明，Tfh細胞及其釋放的細胞因子PD-1與結核病的病情、治療周期、治療效果等存在一定的相關性。因此，監(jiān)測肺結核患者的Tfh細胞水平、PD-1水平，有助于對肺結核進行診斷，對結核病的治療和轉(zhuǎn)歸具有一定的指導意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突