氣相色譜法檢測(cè)飼料添加劑中的檸檬醛、D- 檸檬烯和甲基庚烯酮

◆作者：林茂發(fā)

隨著畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的日益工廠化和工業(yè)化，對(duì)配合飼料的質(zhì)量要求不斷提高，優(yōu)質(zhì)的配合飼料是養(yǎng)殖業(yè)取得成功的基礎(chǔ)，也是養(yǎng)殖企業(yè)為社會(huì)提供綠色安全肉類產(chǎn)品的基本保證。因此，生產(chǎn)出安全、高效、環(huán)保無(wú)公害的配合飼料是飼料生產(chǎn)企業(yè)的目標(biāo)，飼料添加劑作為配合飼料的重要組成之一，對(duì)配合飼料的質(zhì)量有重要的影響，在營(yíng)養(yǎng)成分相當(dāng)?shù)臈l件下，合理使用添加劑可以改善配合飼料的適口性、增強(qiáng)誘食性、增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，減少抗生素等藥物的使用，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)防結(jié)合，提高配合飼料的轉(zhuǎn)化率。

飼料添加劑開(kāi)發(fā)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，尤其是中醫(yī)中藥學(xué)理論在飼料添加劑生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用，大量以中草藥或者植物提取物為主要活性成分的綠色、高效的功能型飼料添加劑被開(kāi)發(fā)出來(lái)并投入飼料加工及養(yǎng)殖中。養(yǎng)殖實(shí)踐證明，采用中藥或植物提取物作為飼料添加劑不會(huì)對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生毒害和殘留，長(zhǎng)期拌料喂養(yǎng)可以提高免疫力，促進(jìn)畜禽和魚(yú)類生長(zhǎng)，改善肉產(chǎn)品的品質(zhì)，是理想的抗生素等獸藥的替代品。飼料添加劑的類型也由單一的成分向多種有效成分混合型的飼料添加劑發(fā)展，相對(duì)于市場(chǎng)上種類繁多的飼料添加劑產(chǎn)品，質(zhì)量監(jiān)管部門提供的檢測(cè)方法顯得有些不足，這給飼料添加劑質(zhì)量監(jiān)管帶來(lái)許多不便，因此有必要對(duì)各種新型飼料添加劑的檢測(cè)方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)和研究。

本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為以山蒼子（Litsea cubeba）鮮果為原料提取出的山蒼子油（Litsea cubeba oil）為主要活性物，以碳酸氫鈣為載體，以大豆油（或其他同類型植物油）為稀釋劑按照一定比例混合均勻而成的飼料添加劑。山蒼子果油是一種天然植物精油，在日化、食品、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用。山蒼子果油具有對(duì)大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌等具有中、高度抑制作用，對(duì)多種真菌具有抑制作用且能降解黃曲霉素同時(shí)具有溫暖脾腎及健胃消食的功能，用作飼料添加劑可以治療動(dòng)物的某些疾病，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，提高配合飼料的轉(zhuǎn)化率，且能改善畜禽和魚(yú)類的肉品質(zhì)，是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑使用目錄（2013）》允許使用的飼料添加劑之一。山蒼子果油組成較為復(fù)雜目前已發(fā)現(xiàn)的有20多種，其主要成分為檸檬醛（橙花醛和香葉醛）、檸檬烯、甲基庚烯酮等。對(duì)山蒼子果油的組成及其活性物的作用，國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了一定的研究，但對(duì)山蒼子果油作為飼料添加劑的應(yīng)用方面研究成果比較少，主要是集中在山蒼子油防霉抑菌應(yīng)用方面，對(duì)山蒼子果油作為飼料添加劑的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究開(kāi)發(fā)出氣相色譜法(GC-FID) 檢測(cè)山蒼子果油飼料添加劑中的特征組分甲基庚烯酮（cas no 110-93-0）、檸檬烯（cas no 5989-27-5）、橙花醛(cas no 141-27-5)、香葉醛 (cas no 5392-40-5)（各化合物的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）。并對(duì)目標(biāo)化合物采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC/MS）進(jìn)行確證。實(shí)驗(yàn)表明該方法準(zhǔn)確快捷，可以用于山蒼子果油混合飼料添加劑的檢測(cè)。

圖1 本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)聯(lián)FID檢測(cè)器及配套工作站（日本SHIMADZU 公司），石英毛細(xì)管柱（ZB-5，30m×0.32mm×0.25μm），美國(guó)Agilent 公司。6890N/5975N氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；ZB-5MS 石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國(guó)Agilent 公司.BT224S分析天平，德國(guó) Sartorius公司；XH－B 旋渦混均器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；調(diào)速多用振蕩器（上海永研超聲設(shè)備有限公司），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) BeckmanCoulter 公司），10mL 具塞玻璃比色管，50mL具塞塑料離心管。

1.2 材料與試劑

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈均為分析純，甲基庚烯酮標(biāo)準(zhǔn)品純度大于99.0%，D- 檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%，橙花醛標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%，香葉醛標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%,以上4 種標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解轉(zhuǎn)移到容量瓶中，并逐級(jí)稀釋成實(shí)驗(yàn)所需的濃度，再配制成相應(yīng)濃度的混標(biāo)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度：250 ℃；色譜柱升溫程序：50 ℃保留 2 min，10 ℃/min 升至 150 ℃，20℃ /min 升至250 ℃保留 2min。檢測(cè)器（FID）溫度：280℃；載氣；氮?dú)猓兌炔恍∮?9.999%）；燃?xì)?；氫氣（純度不小?9.99%）；空氣（壓縮空氣）；氣體流量：柱流量，2.0 mL/min；氫氣 40 mL/min；空氣，400 mL/min；尾吹氣，30 mL/min；進(jìn)樣量：1μL；分流比：30∶1。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1g（精確到0.0001g），置于塑料離心管中，加入4mL 乙酸乙酯渦旋混勻后，在調(diào)速振蕩器上以120 次/min 條件下振搖提取 5min, 經(jīng)過(guò)5000r/min 離心3min 后，吸取上清液于具塞刻度管中，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)一遍，再加入2mL 無(wú)水乙醇按照上述步驟操作一遍。定容到10mL，搖勻，在-18℃條件下速凍 1 小時(shí)，過(guò) 0.45μm 有機(jī)相濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 測(cè)定

在上述選定的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行樣品空白、標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱是影響檢測(cè)組分分離效果的主要因素，因此實(shí)驗(yàn)所選擇色譜柱固定相類型，目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組分極性是本文主要考慮的因素，根據(jù)相似相溶原則，本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)化合物均為弱極性，所以弱極性色譜柱為本實(shí)驗(yàn)首選色譜柱。同時(shí)兼顧研究對(duì)象為山蒼子果油、碳酸氫鈣、大豆油（其他植物油）等經(jīng)過(guò)加工混合而成的因素。因此選擇色譜柱除了要考甲基庚烯酮、D-檸檬烯、橙花醛、香葉醛的分子結(jié)構(gòu)外，還考慮減少基質(zhì)的干擾等因素。本實(shí)驗(yàn)采用了弱、中、強(qiáng)3 種不同極性的色譜柱，分別為ZB-5、ZB-35，ZB-WAX 毛 細(xì) 管色譜柱，綜合考慮靈敏度、峰形、分析時(shí)間、基線漂移等色譜分析因素，ZB-5 毛細(xì)管色譜柱效果最好，因此以ZB-5 毛細(xì)管色譜柱作為本試驗(yàn)用色譜柱。

2.1.2 柱溫和柱流量的優(yōu)化及氣相色譜方法的確定

在確定優(yōu)選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標(biāo)化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。由于甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛之間的沸點(diǎn)差異較大，同時(shí)考慮溶劑聚焦等因素，本研究反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度：250 ℃；色譜柱升溫程序:50 ℃保留 2 min，10 ℃ /min 升至150 ℃，20℃ /min 升至 250 ℃保留 2min。檢測(cè)器 （FID） 溫度280℃，分別取空白基質(zhì)樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液，按確定的色譜條件測(cè)定。結(jié)果空白基質(zhì)樣品在目標(biāo)化合物保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)峰干擾，見(jiàn)圖2、圖3和圖4，表明樣品中其他成分不干擾目標(biāo)化合物測(cè)定，并且能夠在最短的時(shí)間實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物完全分離，方法特異性強(qiáng)，適用于山蒼子果油混合型飼料添加劑甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛含量測(cè)定。

圖2 空白基質(zhì)氣相色譜圖

圖3 空白基質(zhì)加標(biāo)氣相色譜圖

圖4 山蒼子果油飼料添加劑產(chǎn)品氣相色譜圖

表1 不同溶劑對(duì)陽(yáng)性樣品提取效果比較（n=6）

表2 四種目標(biāo)化合物線性方程及定量限

2.2 前處理技術(shù)的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究實(shí)驗(yàn)采用了乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈作為樣品的提取溶劑，對(duì)飼料添加劑樣品進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)（n=6）,實(shí)驗(yàn)表明乙酸乙酯對(duì)4 種目標(biāo)化合物的提取效果最為理想，所以本研究實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取溶劑（見(jiàn)表1）。

2.2.2 提取溶劑體積和提取次數(shù)

樣品中目標(biāo)化合物經(jīng)過(guò)一次4 mL 提取5min 后，可以實(shí)現(xiàn)回收率80%以上，第二遍提取后回收率略有升，第三遍提取對(duì)回收率影響已經(jīng)不顯著，因此本實(shí)驗(yàn)采用提取三遍的方法及提取時(shí)間可以滿足檢測(cè)要求。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性范圍及定量限

將甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 為 0.010、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0mg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在上述的氣相色譜條件下進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明4 種目標(biāo)化合物在（0.01～10.0）mg/mL 范圍內(nèi)均有良好線性，以三倍信噪比（S/N=3） 為 檢 出 限（LOD），S/N=10 為定量限（LQD）得到相應(yīng)定量限在（0.2～0.4）mg/kg 之間，能夠滿足飼料添加劑的檢測(cè)需求（結(jié)果見(jiàn)表2）。

2.3.2 方法的回收率和精密度

向空白基質(zhì)樣品中分別添加Ⅰ( 5g/kg) 、Ⅱ( 10g /kg) 、Ⅲ(50g/kg)三個(gè)濃度水平的混合標(biāo)樣，每個(gè)水平進(jìn)行6 次平行測(cè)定，回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n =6)

表4 樣品溶液穩(wěn)定性 （單位：g/kg）

圖5 空白基質(zhì)加標(biāo)四種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

圖6 山蒼子果油混合型飼料添加劑產(chǎn)品總離子流圖

圖7 四種目標(biāo)化合物質(zhì)譜圖

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述的前處理方法制備樣品溶液，用空白基質(zhì)配制目標(biāo)化合物濃度為50g/kg 的混合樣品溶液，按前述方法測(cè)定四種目標(biāo)化合物含量，樣品溶液密封保存在室溫環(huán)境中，隔 2、4、8、24、48h 測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明樣品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定。

3 GC/MS 確證

同時(shí)稱取山蒼子果油混合型飼料添加劑產(chǎn)品2 份及樣品空白2 份，并在空白基質(zhì)中添加濃度為50 mg/kg 水平的混標(biāo)，按1.3.2 進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測(cè)。

質(zhì)譜條件：載氣為高純氦氣，流速為1.5mL/min；采用分流進(jìn)樣，分流比為40∶1；進(jìn)樣口溫度為 250℃，50 ℃保留 2 min，10℃ /min 升至 150 ℃，20℃ /min升至250 保留2min。離子源為EI 源；電子能量為70eV；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；溶劑延遲5min。采用Scan 掃描模式，50～500 m/z 掃描?？傠x子流圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5 和圖6。

圖8 山蒼子果油混合型飼料添加劑產(chǎn)品氣相色譜圖

4 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的山蒼子果油混合型飼料添加劑進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確稱取樣品 1g （精確至0.0001g），按照 1.3.2 前處理方法實(shí)驗(yàn)。采用 GC-FID 測(cè)定，色譜譜圖見(jiàn)圖7、圖8，測(cè)定結(jié)果與產(chǎn)品明示值相符。

5 結(jié)論

本研究建立的氣相色譜法測(cè)定山蒼子果油混合飼料添加劑中甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛含量的方法，該方法具有前處理技術(shù)簡(jiǎn)單和強(qiáng)特異性優(yōu)點(diǎn)，有較寬的線性范圍和顯著的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率高，重現(xiàn)性好，所使用儀器設(shè)備普及率高，可在山蒼子果油混合型飼料添加劑中甲基庚烯酮、D-檸檬烯、橙花醛、香葉醛的質(zhì)量檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)制定中加以推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：(略）