豆粕固態(tài)發(fā)酵及酶解制備小分子肽的研究

◆作者：閆凱 周玉巖 陳子龍 馮蓓 吳先純

隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活品質(zhì)的提升，人們對(duì)魚、肉、蛋、奶等蛋白類產(chǎn)品需求量日益增加，這推動(dòng)了畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，進(jìn)而推動(dòng)飼料行業(yè)總產(chǎn)量的增加。飼料中蛋白質(zhì)含量一般為25%～50%，主要來源為動(dòng)物蛋白（魚粉為主），但由于動(dòng)物蛋白品質(zhì)容易受原料來源地、運(yùn)輸存貯條件和加工處理方法的影響，因而飼喂效果千差萬別。另外，全球動(dòng)物源蛋白資源日益匱乏，飼料企業(yè)需求量日益增加，蛋白供應(yīng)缺口問題凸顯，引發(fā)原料價(jià)格不斷上漲，飼料生產(chǎn)成本增加。因此，尋找其他蛋白原料替代動(dòng)物蛋白迫在眉睫，也為開發(fā)新的蛋白源產(chǎn)品提供了良好機(jī)遇。

豆粕是大豆經(jīng)壓榨提油后產(chǎn)生的一種農(nóng)副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量一般為30%～50%，富含氨基酸，必需氨基酸平衡性好，營養(yǎng)組分接近動(dòng)物蛋白，可滿足動(dòng)物生長(zhǎng)需求，是一種容易獲取、生產(chǎn)周期短、價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的植物蛋白。但是豆粕蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有α-螺旋、β- 折疊等，一般由四級(jí)結(jié)構(gòu)組成，且80%的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在10 萬道爾頓以上；高度壓縮、折疊等復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)使得大豆蛋白質(zhì)的消化率和生物利用率大幅度下降，因此原料體外預(yù)消化非常重要。米曲霉是美國食品與藥物管理局（FDA）和美國飼料協(xié)會(huì)公布的40 余種安全微生物菌種之一，是中國飼料添加劑品種目錄中一員，是一種被世界公認(rèn)的無害發(fā)酵用微生物菌種。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，能夠分泌多種胞外蛋白酶，且以中性蛋白酶為主（該酶在豆粕蛋白酶解中發(fā)揮主要作用），另外還含有酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶、谷氨酰胺酶等，能耐受較高溫度，抗逆性強(qiáng)，廣泛地應(yīng)用于飼料加工、環(huán)境處理、食品及醫(yī)藥等工業(yè)中。

本實(shí)驗(yàn)以豆粕為原料，經(jīng)米曲霉固態(tài)發(fā)酵制曲、曲料酶解等一系列體外消化處理后噴霧干燥得到營養(yǎng)指標(biāo)高、容易消化的小分子肽產(chǎn)品，是豆粕蛋白深度開發(fā)利用新方式，具有替代或部分替代動(dòng)物蛋白潛能，可減少對(duì)動(dòng)物蛋白的依賴程度，同時(shí)對(duì)飼料加工生產(chǎn)過程中降低生產(chǎn)原料成本具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

米曲霉：滬釀3.042，山東淄博沂源康源生物科技有限公司；帶皮豆粕（粗蛋白質(zhì)43%）：東莞嘉吉油糧有限公司；酪蛋白：北京百靈威科技有限公司；酪氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉、濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉等其他試劑，均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

SDS-III 單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)：湖南中本智能科技有限公司；UV-1700 紫外分光光度計(jì)：日本島津；恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州市華怡儀器制造有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；全自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；萬分之一電子天平：梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；恒溫磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；pH 酸度計(jì)PB-10：賽多利斯；6 米圓盤制曲機(jī)：上海振良食品有限公司；5000L 酶解罐：南京匯科生物工程設(shè)備有限公司；噴霧干燥塔：江蘇省范群干燥設(shè)備有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 豆粕固態(tài)發(fā)酵

帶皮豆粕→加自來水絞龍潤 水 至 50% →115℃ 蒸 煮15min→冷卻至 35～40℃溫度范圍→接米曲霉菌種（按原料量的千分之一）→皮帶輸送至圓盤制曲機(jī)內(nèi)→28～30℃通風(fēng)好氧固態(tài)發(fā)酵→中性蛋白酶活測(cè)定→低溫干燥→粉碎，備用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以氨基酸態(tài)氮生成率為考察指標(biāo)，500mL 三角瓶為酶解反應(yīng)容器，采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行酶解探索，確定最佳酶解條件。底物濃度依次為10%、15%、20%、25%，酶解溫度依次為35℃、40℃、45℃、50℃，酶解時(shí)間依次為 8h、16h、24h、32h、40h。

1.2.3 酶解方法及后處理

豆曲粉碎后加入適量比例自來水混勻→調(diào)節(jié)物料溫度→密閉容器中勻速攪拌，恒溫酶解→取酶解液進(jìn)行測(cè)定→95℃加熱滅活10min→高溫噴霧干燥→產(chǎn)品檢測(cè)。其中酶解時(shí)，每隔8h 取樣，測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定采用福林酚法并略作修改。酶活力單位定義：40℃溫度和 pH=7.5 條件下，1min 水解酪蛋白產(chǎn)生1μg 酪氨酸所需要的酶量定義為1 個(gè)蛋白酶活力單位U，以U/g 表示。

1.2.4.2 氨基酸態(tài)氮、粗蛋白、酸溶蛋白測(cè)定

氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用甲醛滴定法，每次測(cè)定精準(zhǔn)取樣2.00g；粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法，其中粗蛋白質(zhì)測(cè)定精準(zhǔn)取樣0.50g，酸溶蛋白取樣2.00g。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆粕固態(tài)發(fā)酵制曲外觀形態(tài)及中性蛋白酶酶活變化情況

圖1 為圓盤制曲機(jī)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及物料分布情況。圖2 為豆粕固態(tài)發(fā)酵制曲12 小時(shí)，此時(shí)物料表面發(fā)白，長(zhǎng)滿米曲霉菌絲體，菌體生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生大量生物熱。

圖1 圓盤內(nèi)部及物料分布

圖2 發(fā)酵12 小時(shí)后物料外觀

圖3 圓盤制曲過程中曲料中性蛋白酶酶活力變化曲線圖

發(fā)酵過程中，米曲霉分泌中性蛋白酶的多少直接影響豆粕蛋白酶解生成氨基酸態(tài)的效率，因此產(chǎn)酶時(shí)段控制很重要。由圖3 可知，豆粕發(fā)酵制曲過程中，一定時(shí)間范圍內(nèi)中性蛋白酶酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而上升。0-12 小時(shí)，酶活基本沒有，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期米曲霉主要進(jìn)行孢子發(fā)芽和菌絲體生長(zhǎng)，幾乎不合成分泌中性蛋白酶。12～36 小時(shí)，中性蛋白酶活開始合成分泌出胞外，培養(yǎng)36 小時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到頂峰，2457U/g，與張杰、樊君報(bào)道一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中性蛋白酶活性不再增加，可能是發(fā)酵后期菌絲體形成米曲霉孢子體，不再合成分泌中性蛋白酶。

2.2 底物濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

由圖4 可知，豆曲酶解時(shí)底物濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率有一定影響。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%～20%時(shí)，隨著底物濃度的增加，氨基酸態(tài)氮的生成率變化趨勢(shì)一致，其中10%底物濃度最高生成率6.82g/100g（干基，下同），15%底物濃度的為6.67g/100g，20%底物濃度的為6.45g/100g。但隨著底物濃度的繼續(xù)增加，當(dāng)濃度為25%時(shí)，酶解液中氨基酸態(tài)氮生成率大幅度降低，最高為4.72g/100g，可能底物濃度過高，物質(zhì)粘稠，流動(dòng)性差，影響酶分子接觸物料效率及酶解反應(yīng)速率。根據(jù)企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情況，結(jié)合環(huán)保節(jié)能減排要求及后續(xù)噴霧干燥動(dòng)力成本，選用20%底物濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 酶解溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖4 底物濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖5 酶解溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

由圖5 可知，酶解溫度對(duì)氨基酸酸態(tài)氮生成率有明顯影響。隨著酶解溫度的升高，酶解液中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為35℃-40℃時(shí)，隨著溫度的增加，酶解液中氨基酸態(tài)增加明顯，其中40℃對(duì)應(yīng)的氨基酸態(tài)氮生成率為 6.45g/100g（干基，下同）；當(dāng)酶解溫度為40℃-50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率均有降低，其中45℃最高氨基酸態(tài)氮生成率為6.05g/100g，50℃為 3.85g/100g。導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因與中性蛋白酶的最適酶解溫度有關(guān)，該酶最適溫度一般為40～45℃。在適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，酶活性增強(qiáng)，酶解反應(yīng)速度加快，氨基酸態(tài)氮生成率增加；但溫度過高，酶活性降低，穩(wěn)定性差，衰減快，從而影響蛋白質(zhì)酶解度，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮生成率低。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

由圖6 可知，酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率有明顯影響，酶解過程中呈現(xiàn)先增后平穩(wěn)的趨勢(shì)。酶解時(shí)間0-8 小時(shí)，酶解液中氨基酸態(tài)氮生成；酶解8～32 小時(shí)，酶解液中氨基酸態(tài)氮含量繼續(xù)增加，最高為6.45g/100g；當(dāng)酶解時(shí)間大于32 小時(shí)后，氨基酸態(tài)氮生成率開始趨向平穩(wěn)。導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因是豆粕中蛋白質(zhì)氨基酸肽鏈具有多種酶切割位點(diǎn)，蛋白酶的催化酶解反應(yīng)具有高度專一性，故反應(yīng)進(jìn)行到一定程度時(shí)，中性蛋白酶酶切位點(diǎn)以外的其他非特異酶切位點(diǎn)不能被切割，不再釋放氨基酸和小肽。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

2.5 中試酶解及噴霧干燥

采用公司現(xiàn)有5 噸酶解罐，裝載體積70%，底物濃度20%，40℃條件下酶解32 小時(shí)，酶解液氨基酸態(tài)氮為1.33g/100g，氨基酸態(tài)氮生成率6.65g/100g（干基），高于上述三角瓶試驗(yàn)，這是因?yàn)槊附夤薹磻?yīng)控制精準(zhǔn)，酶解條件好原因。酶解反應(yīng)結(jié)束后，酶解液升溫滅活進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥條件：入風(fēng)溫度200℃，出風(fēng)溫度85℃。噴霧干燥產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)后，粗蛋白含量52.83%，小分子肽（酸溶蛋白）含量36.16%，氨基酸態(tài)氮6.32%，豬仿生蛋白質(zhì)消化率82.26%，遠(yuǎn)高于豆粕原料。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以米曲霉滬釀3.042為發(fā)酵菌種，豆粕為原料制曲，探討制曲后曲料酶解過程的各種因素，得到如下結(jié)論：酶解底物濃度20%，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間32 小時(shí)，酶解液氨基酸態(tài)氮含量為1.33g/100g，氨基酸態(tài)氮生成率為6.65g/100g（干基）。酶解液噴霧干燥入風(fēng)溫度200℃，出風(fēng)溫度85℃，得到小分子肽產(chǎn)品粗蛋白含量52.83%、酸溶蛋白36.16%，氨基酸態(tài)氮6.32%，豬仿生蛋白質(zhì)消化率82.26%。該小分子肽粉易消化，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，為豆粕資源蛋白的開發(fā)利用提供新方式與參考，用于飼料生產(chǎn)替代或部分替代魚粉將有廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)：（略）